Manuale di Base sulla Cromatografia Liquida Preparativa

Sebbene le separazioni complesse siano maggiormente influenzate dalla selettività del materiale di impaccamento della colonna, quando si sviluppa un metodo di separazione mirato alla purificazione, è più efficiente iniziare con l’ottimizzazione della separazione del campione generata con un gradiente di esplorazione rapido. Lo scopo dei gradienti di esplorazione è determinare la concentrazione approssimativa di solvente necessaria per eluire uno o più composti di interesse dalla colonna. I gradienti di esplorazione iniziano in genere dalla stessa concentrazione di solvente forte (2%-10%) e incrementano linearmente fino a 25%, 75%, 50% e 90%-95%.

Al termine dei gradienti di esplorazione, i risultati vengono esaminati e valutati mediante una serie di domande prima di passare al passaggio successivo:

• Il gradiente di esplorazione rapido fornisce una separazione adeguata per il composto di interesse?
• Il gradiente di esplorazione rapido è adeguato alla velocità o all’efficienza?
• La separazione del composto di interesse dagli altri picchi può essere mantenuta al carico di campione richiesto?

Se il gradiente di esplorazione non produce un risultato adeguato, può essere ottimizzato attraverso la focalizzazione del metodo o, in alternativa, la separazione può essere modificata interamente tramite il pH, il solvente o altre variabili cromatografiche.

Ottimizzazione del Metodo

L’analisi di esplorazione che fornisce la massima risoluzione per il composto di interesse può essere ottimizzata modificando la composizione dei solventi forti e deboli. La composizione può rimanere costante (isocratica) oppure può cambiare per una determinata unità temporale o volume di colonna (gradiente).

Eluizione Isocratica

In una separazione isocratica il solvente debole e il solvente forte vengono mantenuti in un rapporto invariato per unità temporale. Il solvente isocratico può essere preparato offline dall’analista o miscelato in linea con una pompa HPLC in grado di dosare i diversi solventi a una velocità costante e predeterminata. Questa modalità di eluizione è pratica, coerente e robusta poiché l’influenza del tempo di ritenzione causata dal volume di sosta è trascurabile mentre un metodo viene trasferito da un sistema a un altro.

L’eluizione isocratica presenta degli inconvenienti e potrebbe non essere appropriata per tutte le separazioni. Esistono problemi intrinseci tra cui una scarsa risoluzione dei picchi a eluizione precoce, una riduzione della simmetria dovuta allo scodamento del picco, una riduzione della sensibilità dovuta all’allargamento della banda e problemi di contaminazione della colonna dovuti all’accumulo di composti a forte ritenzione.

Eluizione a Gradiente

Le separazioni a gradiente in fase inversa o a scambio ionico comportano in genere la miscelazione in linea della fase mobile per ottenere un incremento costante del solvente organico nel corso dell’analisi. All’inizio del gradiente, quando la forza del solvente è bassa, l’analita viene partizionato nella fase stazionaria o rimane in testa alla colonna. All’incrementare della forza del solvente, l’analita viene trasferito alla fase mobile, si sposta lungo la colonna e infine viene eluito.

L’eluizione in gradiente consente di separare analiti con un ampio intervallo di idrofobicità in un intervallo di tempo ragionevole. Ulteriori vantaggi possono includere una migliore risoluzione dei picchi e una maggiore sensibilità grazie alla maggiore altezza del picco. Il deterioramento della colonna viene ridotto al minimo anche quando i componenti a forte ritenzione vengono lavati dalla colonna alla fine dell’analisi.

L’eluizione in gradiente presenta anche degli svantaggi. È necessaria una miscelazione a gradiente in linea coerente e priva di impulsi; pertanto, spesso è necessaria una costosa strumentazione di pompe. Inoltre, può verificarsi una precipitazione quando alcune fasi mobili sono miscelate in determinate combinazioni. I tempi di analisi possono essere lunghi a causa della riequilibrazione post-gradiente e il dwell time (Vd) diverso degli strumenti può causare problemi di trasferimento del metodo, senza una compensazione adeguata.

Gradiente Lineare

I gradienti lineari progrediscono con un incremento costante della composizione del solvente forte durante l’intera analisi. Spesso sono utilizzati in esperimenti di screening rapido per determinare velocemente il rapporto tra i solventi che eluisce il picco di interesse e per mantenere il tempo di analisi ragionevolmente breve, il che si traduce in un’eluizione in meno tempo, riducendo le tempistiche e i costi del solvente.

Gradiente Segmentato

Un gradiente segmentato è una combinazione di una serie di gradienti lineari, ciascuno con una pendenza o ripidità diversa. I segmenti poco profondi risolvono i composti di interesse, mentre i segmenti ripidi sono aree del cromatogramma in cui non viene richiesta un’alta risoluzione, ad esempio in un lavaggio post-separazione.

I gradienti focalizzati sono in genere più brevi e più esagerati rispetto ai gradienti segmentati. In genere, la forza del solvente è molto bassa subito dopo l’iniezione. Quindi viene incrementata rapidamente a un valore compreso tra il 2% e il 5% al di sotto del rapporto tra i solventi richiesto per l’eluizione del composto di interesse (cioè la concentrazione di eluizione del 22% – 2% = 20% di gradiente superficiale iniziale). Un gradiente superficiale procede quindi a circa 1/5 della pendenza determinata nella separazione di esplorazione rapida per terminare infine tra il 2% e il 5% al di sopra della concentrazione di eluizione per il composto di interesse (cioè 22% + 2% = 24% di gradiente superficiale finale). Infine, la percentuale di solvente viene incrementata rapidamente per lavare la colonna da eventuali componenti del campione rimanenti.

Sviluppo di un Gradiente Focalizzato

I seguenti calcoli possono essere utilizzati per generare un gradiente focalizzato per il composto di interesse dopo che il campione è stato analizzato con un gradiente di esplorazione rapido. Ogni equazione è seguita da un esempio teorico.

In primo luogo, è necessario determinare il volume di sosta del sistema per lo strumento utilizzato per l’analisi del gradiente di esplorazione. Le istruzioni per la determinazione del volume di sosta sono disponibili nella sezione “Determinazione del volume di sosta” del presente manuale di base oppure nello strumento applicativo “Analytical to Prep Gradient Calculator” all’indirizzo www.waters.com/prepcalculator.

Inoltre, è necessario determinare il volume della colonna utilizzata per l’analisi di esplorazione. Può essere calcolato utilizzando il volume di un cilindro V = πr²h e compensando il volume occupato dal materiale di impaccamento, cioè V = πr²h (66%). Per eseguire questo calcolo è possibile utilizzare anche lo strumento applicativo Analytical to Prep Gradient Calculator.

Equazione 1: volume della colonna

Volume della colonna = π r² x altezza x 66% disponibile per la fase mobile/1000 per convertire i mm³ in mL

Esempio:

CV = 3,14 x (4,6 mm/2)² x 50 mm x 0,66/1000
CV = 548 mm³ = 0,548 mL

Equazione 2: volume di offset tra la formazione del gradiente e il rivelatore

Volume di offset = volume del sistema* + volume della colonna
*Volume del sistema o volume di sosta

Esempio:

Volume di offset = 1,04 mL + 0,548 mL
Volume di offset = 1,588 mL

Equazione 3: tempo prima del rivelatore

Tempo prima del rivelatore = offset in mL/velocità di flusso in mL/min

Esempio:

Tempo prima del rivelatore = 1,588 mL/1,5 mL/min
Tempo prima del rivelatore = 1,06 min

Equazione 4: tempo di formazione della concentrazione di eluizione

Tempo di formazione della concentrazione di eluizione = tempo di ritenzione del picco di interesse – tempo prima del rivelatore – attesa del gradiente

Esempio:

Tempo di formazione della concentrazione di eluizione = 6,0 min – 1,06 min – 0,0 min
Tempo di formazione della concentrazione di eluizione = 4,94 min

Equazione 5: concentrazione percentuale di eluizione

Concentrazione % di eluizione = tempo di formazione della concentrazione di eluizione/lunghezza del segmento del gradiente di esplorazione x modifica esplorazione (% del gradiente di esplorazione iniziale)

Esempio:

Concentrazione % di eluizione = 4,94 min/6,0 min x 90% + 5%
concentrazione % di eluizione = 79,1%

Equazione 6: numero di volumi di colonna (CV)

Numero di volumi di colonna = volume di colonna 1/mL x flusso mL/min x lunghezza del segmento del gradiente di esplorazione

Esempio:

N. CV = CV 1/0,548 mL x 1,5 mL/min x 6 min
N. CV = 16,4

Equazione 7: pendenza del gradiente di esplorazione

Pendenza del gradiente di esplorazione = % di modifica del gradiente di esplorazione/n. volumi di colonna

Esempio:

Pendenza del gradiente di esplorazione = (95% – 5%)/16,4 CV
Pendenza del gradiente = 5,49%/CV

Equazione 8: pendenza del gradiente focalizzato

Pendenza del gradiente focalizzato = 1/5 x pendenza del gradiente di esplorazione

Esempio:

Pendenza del gradiente focalizzato = 1/5 x 5,49%/CV
Pendenza del gradiente focalizzato = 1,1%/CV

Il segmento del gradiente focalizzato viene creato dal 5% in giù, al 3%-5% al di sopra della percentuale di eluizione stimata. Per esempio, la percentuale di eluizione è del 79%.

Equazione 9: durata del segmento del gradiente focalizzato

Lunghezza del segmento del gradiente focalizzato = intervallo % x (1/pendenza del gradiente di esplorazione) x volume della colonna x (1/velocità di flusso)

Esempio:

Lunghezza del segmento del gradiente focalizzato = (79%+5%) - (79%-5%) x (1/1,1%) x (0,548 mL) x (1/1,5 mL/min)
Lunghezza del segmento del gradiente focalizzato = 3,32 min

L’ultimo passaggio consiste nello scrivere il gradiente focalizzato utilizzando i valori calcolati nelle formule precedenti.