Guida all’SPE per Principianti

Gli scienziati incaricati di svolgere analisi devono affrontare molte sfide nel determinare quali strumenti sia meglio utilizzare per ottenere i risultati desiderati. Stabilire gli strumenti e gli approcci a cui affidarsi per la preparazione dei campioni è un aspetto importante che può incidere in modo significativo sulla buona riuscita dell’operazione.

L’ideale sarebbe non dover effettuare alcuna preparazione dei campioni. In realtà, tuttavia, quest’ultima è spesso necessaria. Potrebbe essere necessario ottimizzare un metodo per un campione esistente al fine di migliorare la produttività o ridurre il costo per analisi. In alternativa, potrebbe essere richiesto di analizzare un’ampia varietà di tipi di campioni diversi per fornire resoconti su nuovi composti di interesse. Ogni tipo di campione nuovo può presentare problemi diversi dal punto di vista analitico. Inoltre, gli scienziati oggi devono affrontare una grande sfida: riportare i valori a livelli di concentrazione più bassi di sempre, senza compromettere l’accuratezza e la precisione.

Questo manuale è stato ideato per aiutare l’utente a esplorare e comprendere uno strumento molto potente nella tecnologia di preparazione dei campioni: l’estrazione in fase solida (SPE). Vedrete come questa tecnologia, che si avvale di dispositivi con materiale di impaccamento cromatografico, può aiutare a far fronte alle vostre sfide analitiche.

Definizione di estrazione in fase solida

La SPE è una tecnologia di preparazione dei campioni che utilizza materiale di impaccamento cromatografico con particelle solide, generalmente contenuto in un dispositivo a cartuccia, per separare chimicamente i diversi componenti di un campione. I campioni si trovano quasi sempre allo stato liquido (sebbene per applicazioni specifiche alcuni campioni possano essere in fase gassosa). La Figura 1 mostra un campione, di colore nero, processato su un dispositivo SPE in modo che i singoli composti coloranti, che compongono il campione, siano separati per via cromatografica.

I vantaggi dell’utilizzo della SPE sono numerosi, ma quattro di essi meritano un’attenzione particolare.

1. Semplificazione della matrice del campione complesso e purificazione dei composti

Uno dei problemi più spinosi per un utente di laboratorio di chimica analitica si verifica quando i composti di interesse sono contenuti nella matrice di un campione complesso, come le micotossine nei cereali, i residui di antibiotici nei gamberi o i metaboliti dei farmaci nel plasma, nel siero o nelle urine. L’elevato numero di costituenti o sostanze interferenti nella matrice del campione, unitamente ai composti di interesse, rende l’analisi estremamente difficile.

Il primo problema da risolvere è la conseguente complessità dell’analisi dovuta alla presenza di un numero così elevato di entità che devono essere separate per identificare e quantificare il composto o i composti di interesse. Fare riferimento alla Figura 2.

La robustezza del saggio potrebbe non essere adeguata, in quanto qualsiasi lieve modifica potrebbe influire sulla risoluzione della separazione di una coppia critica di analiti.

Inoltre, la presenza di tutte le interferenze nella matrice del campione originale può comportare tempi di fermo dello strumento a causa di un accumulo di contaminazione a ogni iniezione. Se le interferenze fossero rimosse nell’ambito della preparazione del campione, i composti di interesse potrebbero essere analizzati con un metodo più semplice e affidabile. La Figura 3, che confronta il campione originale in alto con il nuovo campione preparato tramite SPE in basso, illustra questo aspetto.

Un ulteriore vantaggio che risulta dalla semplificazione della matrice del campione è la maggiore accuratezza in termini di quantificazione. La traccia blu superiore relativa al composto 1 nella Figura 4 sembra inizialmente accettabile. Tuttavia, in realtà presenta una certa contaminazione dovuta alla matrice del campione rispetto alla traccia della matrice del bianco in rosso appena sotto di essa. Con un protocollo SPE adeguato, le tracce inferiori mostrano gli stessi composti senza problemi di interferenza, rendendo la quantificazione molto più accurata.

La Figura 5 mostra un altro esempio. La traccia superiore mostra un’interferenza significativa della matrice del campione per i composti 1 e 2. La traccia inferiore mostra risultati nettamente migliori (linea di base pulita) grazie alla corretta preparazione del campione tramite la SPE. Si noti che una linea di base molto più pulita migliora l’accuratezza dei risultati analitici. Inoltre, è possibile ottenere un estratto molto più puro se il campione richiede l’isolamento e la purificazione di tale composto.

2. Riduzione della soppressione ionica o miglioramento delle applicazioni MS.

Il secondo problema relativo alle matrici dei campioni complessi può essere osservato quando si esamina il risultato dello spettrometro di massa [LC-MS o LC/MS/MS]. Per ottenere una risposta adeguata del segnale MS (sensibilità), il composto ionico deve potersi formare correttamente. Nei casi in cui la formazione del composto ionico è soppressa da interferenze nella matrice del campione, l’intensità del segnale è notevolmente ridotta.

Questo effetto è illustrato nella Figura 6. Il risultato superiore rappresenta il segnale relativo ai composti di interesse quando vengono iniettati in una soluzione salina. La traccia inferiore mostra una riduzione significativa della risposta [soppressione > 90%] di questi stessi composti quando sono stati analizzati nel plasma umano. Per la traccia inferiore è stato eseguito solo un passaggio comune di precipitazione delle proteine. Questa tecnica non elimina le interferenze della matrice che causano la soppressione ionica, con conseguente scarsa risposta del segnale.

La Figura 7 mostra un altro buon esempio dell’effetto di soppressione. Nella traccia superiore del risultato MS, dove il campione di plasma è stato preparato con un solo passaggio di precipitazione delle proteine, è possibile osservare che il picco di terfenadina è soppresso dell’80%. Nella traccia inferiore, dove lo stesso campione è stato preparato utilizzando un metodo SPE, è possibile osservare una soppressione ionica minima. La rimozione delle interferenze dalla matrice del campione ha consentito al composto ionico di formarsi correttamente, creando un segnale migliore.

In alcuni casi, le interferenze della matrice del campione possono aumentare in modo artificioso il segnale riportato per un composto. Questo fenomeno è noto come “potenziamento ionico” e genera un valore riportato impropriamente alto. Un metodo SPE adeguato ridurrà al minimo questo effetto eliminando le interferenze dal composto e consentendo di ottenere così un valore riportato più accurato.

3. Possibilità di frazionare la matrice del campione per analizzare i composti in base alla classe

Un tecnico potrebbe trovarsi di fronte a un campione che contiene molti composti, dovendo separarli per classe in modo da poter eseguire ulteriori analisi in maniera molto più efficiente. Per esempio, la formulazione di una bibita analcolica contiene una vasta gamma di composti. Si potrebbe sviluppare un metodo SPE per separare le diverse classi di composti, per esempio in base alla loro polarità. I composti polari possono essere raccolti, come frazione separata, dai composti maggiormente apolari. Queste due frazioni potrebbero quindi essere analizzate separatamente in modo molto più efficiente perché i loro composti sarebbero più simili.

La Figura 8 mostra un esempio della potenza del frazionamento tramite SPE. In questo caso, un campione complesso di polvere secca (preparazione per bevanda all’uva) viene facilmente separato in quattro frazioni: una frazione dei soli composti polari, un composto rosso purificato, un composto blu purificato e una frazione contenente tutti i rimanenti composti non-polari. In un altro punto di questo manuale si potrà osservare l’importanza di questa potenzialità.

Per una trattazione più dettagliata del frazionamento del campione tramite SPE, vedere pagina 125 nella sezione Method Development (Sviluppo del metodo).

4. Concentrazione in tracce (arricchimento) di composti di livello molto basso

I tecnici odierni hanno spesso bisogno di segnalare composti a livelli di concentrazione molto più bassi rispetto al passato, a partire da parti per trilione (ppt) e anche inferiori. In genere questi livelli nel campione puro sono inferiori rispetto alla sensibilità degli strumenti analitici.

A tal proposito, un buon esempio è costituito dall’analisi per individuare tracce di contaminanti nei campioni ambientali o lo sviluppo di metaboliti nei fluidi biologici nel corso del tempo. La traccia superiore nella Figura 9 mostra la scarsa risposta del campione puro originale per il composto di interesse. In condizioni di analisi identiche, ma con il campione preparato tramite SPE utilizzato in una strategia di concentrazione in tracce, la traccia inferiore mostra un notevole aumento dell’intensità del segnale in relazione a questo composto. Con questo risultato è possibile effettuare un calcolo accurato della concentrazione originale del composto nel campione puro.

Senza la capacità di ritenzione dei materiali di impaccamento cromatografici nella SPE, la possibilità di tracciare il concentrato di uno o più composti specifici sarebbe molto difficile, se non impossibile, con altri approcci alla preparazione dei campioni.

Riepilogo

Come abbiamo visto, un dispositivo SPE con letto cromatografico può eseguire quattro funzioni critiche per rendere più efficace l’analisi del campione. Fare riferimento alla Figura 10.

In questo manuale abbiamo cercato di illustrare le basi della SPE e le tecniche di successo frutto del lavoro di scienziati di tutto il mondo che hanno fatto affidamento su questa tecnologia negli ultimi trent’anni. Oggi gli scienziati ritengono che la SPE sia più utile che mai per risolvere problemi analitici e di preparazione dei campioni.

Ci auguriamo che questo manuale consenta all’utente di comprendere e padroneggiare la SPE, in modo da riuscire a sfruttare i vantaggi di questa tecnologia in laboratorio.