Guida all’UPLC per Principianti

Nella sezione precedente è stato indicato il vantaggio di particelle cromatografiche più piccole e della riduzione dell’allargamento di banda del sistema [strumento e colonna]. La tecnologia UPLC consente di migliorare il rendimento cromatografico riducendo al minimo l’allargamento di banda del sistema per produrre separazioni più efficienti in meno tempo, ottenendo così una migliore qualità dei dati. Tuttavia, l’allargamento di banda non è l’unico fattore che determina le prestazioni che si possono ottenere con particelle di piccole dimensioni. Anche la pressione disponibile dello strumento svolge un ruolo importante.

La pressione viene generata a livello intrinseco quando la fase mobile attraversa il tubo di collegamento tra la pompa e l’iniettore, tra l’iniettore e la colonna, la colonna stessa, il post-colonna del tubo e la cella del rivelatore. La misurazione della pressione del sistema avviene per effetto cumulativo di tutti questi componenti [strumento e colonna]. All’incrementare della velocità di flusso, incrementerà anche la pressione prodotta dalla fase mobile che fluisce attraverso il tubo di collegamento. Inoltre, anche il diametro interno e la lunghezza del tubo incidono sulla pressione generata in combinazione alla velocità di flusso. La differenza di pressione tra due colonne può essere confrontata con le previsioni teoriche sottraendo la pressione generata dallo strumento dalla pressione totale del sistema [strumento + colonna].

Al ridurre la dimensione delle particelle, la contro-pressione incrementa a una velocità inversamente proporzionale al quadrato del diametro delle particelle. Contemporaneamente, la velocità ottimale della fase mobile [velocità lineare] incrementa col ridursi del diametro delle particelle. Pertanto, la pressione alla velocità lineare ottimale per una data dimensione delle particelle incrementa a una velocità inversamente proporzionale al cubo del diametro delle particelle [Figura 44].

Si tratta di una limitazione significativa quando si tenta di utilizzare colonne con particelle più piccole su strumentazione HPLC convenzionale per migliorare la risoluzione cromatografica [mantenendo costante la lunghezza della colonna, ma riducendo la dimensione delle particelle] o per migliorare la velocità di analisi mantenendo la risoluzione [mantenendo costante il rapporto L/d_p]. A causa dei limiti di pressione degli strumenti HPLC convenzionali

[350-400 bar; 5000-6000 psi], l’uso di particelle più piccole spesso comporta una limitazione della lunghezza della colonna o il funzionamento a velocità lineari [velocità di flusso] non ottimali.

Per una colonna di lunghezza costante, la teoria prevede che se la dimensione delle particelle viene ridotta da 5,0 µm a 1,7 µm [diminuzione delle dimensioni delle particelle di 3´], la contro-pressione dovrebbe incrementare di 27´. Praticamente in linea con le previsioni teoriche, la pressione del sistema è incrementata di 22´ durante la transizione da una colonna da 5,0 µm a una da 1,7 µm della stessa lunghezza. Come osservato, la colonna da 1,7 µm funziona ben al di sopra del limite di pressione superiore di uno strumento HPLC convenzionale [Figura 45].

Il forte incremento della contro-pressione osservato con la riduzione delle dimensioni delle particelle è uno dei motivi principali per cui le colonne con particelle inferiori a 2 µm [e i corrispondenti strumenti LC] non hanno mai avuto successo commerciale prima dell’utilizzo del sistema ACQUITY UPLC.

Se la separazione ha l’obiettivo di mantenere la risoluzione, ma di ridurre il tempo di analisi [mantenendo costante il rapporto L/d_p], l’incremento di pressione è molto inferiore rispetto al mantenimento di una lunghezza costante della colonna riducendo le dimensioni delle particelle. La variazione di pressione è inversamente proporzionale al quadrato della dimensione delle particelle [piuttosto che alla dimensione delle particelle al cubo] a causa della riduzione proporzionale della lunghezza della colonna.

In questo esempio, sia la lunghezza della colonna che la dimensione delle particelle vengono ridotte di 3´ [Figura 47]. Significa che si prevede un incremento della contro-pressione di 9´. I valori osservati corrispondono fedelmente alle previsioni teoriche. Mantenendo il L/d_p costante, si osserva un incremento di 11´ della contro-pressione in caso di transizione da una colonna da 5,0 µm lunga 150 mm a una da 1,7 µm lunga 50 mm.

In caso di analisi alla velocità di flusso ottimale, la pressione prodotta dalle particelle più piccole supera i limiti di pressione dei sistemi HPLC convenzionali. Il sistema ACQUITY UPLC [limite superiore di pressione di 1030 bar, 15 000 psi] è stato progettato per adattarsi a queste pressioni, consentendo il corretto funzionamento delle particelle inferiori a 2 µm alla velocità di flusso ottimale.

Temperatura Elevata

Un approccio alla compensazione delle pressioni più elevate prodotte da particelle di piccole dimensioni consiste nell’aumentare la temperatura della colonna. Con l’incrementare della temperatura della colonna, la viscosità della fase mobile diminuisce, con conseguente riduzione della contro-pressione [se la velocità di flusso viene mantenuta costante]. Tuttavia, incrementa anche la velocità di entrata e uscita delle molecole dell’analita dai pori della fase stazionaria [diffusione], con conseguente necessità di incrementare la velocità di flusso per mantenere le prestazioni.

Quando si incrementa la temperatura della colonna da 30 °C a 90 °C, è necessario incrementare la velocità di flusso per mantenere l’efficienza [Figura 48]. Non si osserva nessun guadagno in termini di efficienza confrontando i piatti teorici maggiori a entrambe le temperature, in accordo con la teoria cromatografica.

Un confronto più interessante può essere effettuato tracciando i piatti teorici rispetto alla pressione del sistema [Figura 49]. Tracciando i dati in questo modo, è possibile vedere chiaramente che la massima efficienza della colonna viene raggiunta indicativamente alla stessa pressione di sistema, in maniera indipendente dalla temperatura di separazione. Significa che non è possibile utilizzare una temperatura elevata per aggirare le pressioni associate all’uso di particelle di piccole dimensioni. In altre parole, uno strumento HPLC convenzionale non è adatto per utilizzare particelle molto piccole in maniera efficiente.