Manuale di Base sulla Cromatografia Liquida Preparativa

1. Antioxidant Isolation Using the Prep 150 LC System.
2. Peptide Isolation Using the Prep 150 LC System.
3. Purification of Cannabinoid from Hemp Oil Using the Prep150 LC System.
4. Isolation of Flavonoids from Ginko Biloba Leaf Using the Waters Prep 150 LC System.
5. Isolation of a Natural Product from Echinacea Extract Using the Prep 150 LC.
6. Streamlining Compound Isolation Automatically with UPLC to Prep Chromatography Using Mass-Directed AutoPurification.
7. Mass-Directed Isolation of a Synthetic Peptide Using the ACQUITY QDa Detector.
8. Strategies for Improving Isolation Using Large Volume Leading and Easy Method Development in Prep Chromatography.
9. Techniques for Improving the Efficiency of Large Volume Loading in Prep Liquid Chromatography.
10. Purificazione di Composti Sulfamidici in una Miscela di Antibiotici sfruttando l’analisi di Massa con il Rivelatore ACQUITY QDa.
11. Mass Directed Isolation pf a Pharmaceutical Compound Using AutoPurify with an ACQUITY QDa Detector.
12. Condizioni Tipiche di un Rivelatore ACQUITY QDa per l’Analisi e la Purificazione di Composti di una Miscela Standard utilizzando la Cromatografia Preparativa.
13. Preparatory Chromatography of Natural Product Extracts Utilizing a UV-Based Open Access Walk-up Purification Strategy.
14. A modular Prep HPLC System for the Isolation of Puerarin from Kudzu Root Extracts.
15. Improving Resolution and Column Loading Systematically in Prep Liquid Chromatography for Isolating a Minor Component from Peppermint Extract.
16. Small Scale Peptide and Impurity Isolation Using the ACQUITY UPLC H-Class and Waters Fraction Manager-Analytical Systems.
17. Small Scale Purification of Constituents from Complex Natural Product Extracts Using ACQUITY H-Class and Waters Fraction Manager- Analytical Systems.
18. At-Column-Dilution, Note applicative, Revisione A, Waters Corp, 2003. Per maggiori informazioni su Riferimenti e note applicative utili, visitare il sito www.waters.com e inserire i numeri di riferimento blu specifici nella casella di ricerca. 

CONCLUSIONE: 

• Diluizione in colonna: tecnica di iniezione brevettata che incrementa la capacità di massa e la durata della colonna; inoltre, migliora la risoluzione e la robustezza del sistema LC diluendo il campione in un solvente forte in testa alla colonna. Cromatogramma: rappresentazione grafica o di altro tipo della risposta del rivelatore o di un’altra quantità utilizzata come misura della concentrazione dell’analita nell’effluente in funzione del volume dell’effluente o del tempo. Volume della colonna (V_c), V_c = π x (r)² x altezza x 66% disponibile per la fase mobile / 1000 per convertire i mm³ in mL: volume geometrico della parte del tubo che contiene l’impaccamento (area della sezione trasversale interna del tubo moltiplicata per la lunghezza del letto di impaccamento L con compensazione per lo spazio occupato dal materiale di impaccamento, 66%), su una piccola porzione del flusso verso il rivelatore mentre la porzione principale va alle separazioni del raccoglitore di frazioni, il volume di sosta è ancora presente, ma poiché la concentrazione della fase mobile è costante, non si osserva nessuna differenza tra i cromatogrammi eseguiti su sistemi a volume di sosta diversi. Eluito, Eluente, Eluire: per eluito si intende la porzione dell’eluente che fuoriesce o eluisce dall’uscita della colonna contenente gli analiti in soluzione. Nell’HPLC analitica, l’eluito viene esaminato dal rivelatore per verificare la concentrazione o la massa degli analiti. Nell’HPLC preparativa, l’eluito viene raccolto in modo continuo in aliquote a intervalli di tempo o di volume uniformi, oppure in modo discontinuo solo quando un rivelatore indica la presenza di un picco di interesse. Queste frazioni vengono successivamente processate per ottenere composti purificati. Idrofobico: qualità di molecole o radicali non polari che sono più solubili nei solventi organici che in acqua. Cromatografia a scambio ionico: la cromatografia a scambio ionico (o cromatografia ionica) è un processo cromatografico che separa gli ioni e le molecole polari in base alla loro affinità con lo scambiatore ionico. La tecnica di separazione viene utilizzata per qualsiasi tipo di molecola carica, per esempio le proteine di grandi dimensioni, i nucleotidi di piccole dimensioni e gli amminoacidi. Isocratica: la composizione della fase mobile rimane costante nel corso di una separazione cromatografica. Solvente di reintegro: solvente utilizzato per diluire e trasferire il campione suddiviso dal flusso di preparazione ai rivelatori in un sistema di purificazione a controllo di massa. Fase mobile: solventi utilizzati per eluire i composti da una colonna HPLC. Velocità di flusso: volume della fase mobile che attraversa la colonna nell’unità di tempo. Iniettore (campionatore automatico, sistema di gestione campioni): meccanismo usato per introdurre (iniettare) in modo accurato e preciso un volume predeterminato di una soluzione di campione nel flusso della fase mobile. Eluizione isocratica: la composizione della fase mobile rimane costante durante il processo di eluizione. Fase mobile: fluido che si sposta, in una direzione definita, attraverso la lunghezza del letto sorbente di fase stazionaria. Picco: registrazione della risposta del rivelatore durante l’eluizione di un singolo componente dalla colonna. Risoluzione (Rs): separazione di due picchi espressa come la differenza dei rispettivi tempi di ritenzione divisa per l’ampiezza media dei picchi alla linea di base. R_s = 1,25 indica che due picchi di uguale ampiezza sono separati solo sulla linea di base. Quando R_s = 0,6, l’unica indicazione visiva della presenza di due picchi su un cromatogramma è una piccola tacca in prossimità dell’apice del picco. Tempo di ritenzione (RT): tempo che intercorre tra l’inizio dell’iniezione o dell’introduzione del campione e l’insorgenza dell’apice del picco. Selettività: termine utilizzato per descrivere l’entità della differenza tra le affinità relative di una coppia di analiti per le fasi mobile e stazionaria specificate che compongono il sistema di separazione. Scala (scale-up): la quantità di isolato purificato desiderata per ciascun isolamento determina la scala, il diametro della colonna, il sistema e i requisiti hardware. La quantità può variare dall’isolamento o dalla purificazione di piccole quantità in µg di enzimi a grandi quantità in kg necessarie per le operazioni di produzione industriale di farmaci. Lo scale-up è la produzione di maggiori quantità di un composto specifico per un’ulteriore valutazione dopo una dimostrazione iniziale del valore potenziale. Gradiente a gradini: metodo di separazione che mantiene la pendenza prima e dopo una parte bassa e focalizzata del gradiente, conservando in tal modo il profilo cromatografico per queste parti della separazione, spesso utilizzato per determinare il volume di sosta del sistema. Silanolo: gruppo chimico legato al materiale di impaccamento della colonna del substrato di silice disponibile per l’interazione con il campione. Divisore: utilizzato per deviare una piccola porzione del flusso del campione verso un rivelatore distruttivo, per esempio nella purificazione con spettrometria di massa. Fase stazionaria: solido poroso (per esempio vetro, silice o allumina) impaccato in un tubo di vetro o metallo, o che costituisce le pareti di un capillare a tubo aperto; la fase mobile fluisce attraverso il letto impaccato o la colonna, il campione da separare viene iniettato all’inizio della colonna e trasportato attraverso il sistema dalla fase mobile; le varie sostanze si distribuiscono a seconda della loro affinità relativa per le due fasi. Produttività: vantaggio derivante dall’utilizzo di separazioni LC a velocità lineari più elevate utilizzando colonne analitiche a volume ridotto e a particelle più piccole o colonne di preparazione a volume elevato a particelle di grandi dimensioni; risoluzione, velocità ed efficienza superiori in genere garantiscono una produttività superiore; si possono purificare quantità maggiori di composto per ciascuna analisi o periodo di processo.

GLOSSARIO

1. Volume del sistema: volume di sosta, volume di ritardo, volume del sistema dal punto di miscelazione dei solventi della fase mobile fino a raggiungere la testa della colonna; per i sistemi LC con miscelazione ad alta pressione, include il miscelatore, il tubo di collegamento e il loop del campionatore automatico come componenti primari, di importanza pratica solo per le applicazioni a gradiente.
2. Rapporto di frazionamento: quantità di materiale “rimosso” e diluito continuamente dal flusso del campione prima del trasferimento ai rivelatori durante la purificazione a controllo di massa.
3. Cromatografia in size exclusion: separazione cromatografica dei composti in base alle loro dimensioni in soluzione.
4. Gradiente superficiale: gradiente a bassa velocità di variazione della concentrazione del solvente organico per volume di colonna e utilizzato per separare i composti con affinità simile per la matrice della colonna.
5. Gradiente segmentato: metodo di separazione che include diversi gradienti con pendenze diverse per separare più composti con selettività diversa alla massima produttività.
6. Sensibilità (S): segnale in uscita per ciascuna concentrazione o massa unitaria di una sostanza nella fase mobile che entra nel rivelatore; nel caso dei rivelatori sensibili al flusso di massa, è il rapporto tra altezza del picco e massa unitaria.
7. Cromatografia in fase inversa: procedura di eluizione utilizzata nella cromatografia liquida in cui la fase mobile è notevolmente più polare della fase stazionaria.
8. Fattore di ritenzione (k): misura del tempo in cui il componente del campione rimane nella fase stazionaria rispetto al tempo in cui rimane nella fase mobile; esprime il tempo di rallentamento di un componente del campione da parte della fase stazionaria rispetto a quello necessario per percorrere la colonna alla velocità della fase mobile.
9. Cromatografia preparativa: processo di utilizzo della cromatografia liquida per isolare un composto in quantità e purezza sufficienti per ulteriori esperimenti o utilizzi.
10. Divisore passivo: dispositivo utilizzato per campionare ininterrottamente il flusso principale o il flusso di preparazione con un rapporto di frazionamento definito; gestisce il segnale del rivelatore nella purificazione a controllo di massa.
11. Cromatografia liquida (LC): tecnica di separazione in cui la fase mobile è un liquido.
12. Ingresso: estremità del letto della colonna da cui entrano il flusso della fase mobile e il campione.
13. Gradiente: variazione nel tempo delle concentrazioni relative di due (o più) componenti di solvente miscibili che formano una fase mobile con forza di eluizione crescente.
14. Modificatore di fase mobile: additivi miscelati nei solventi cromatografici per migliorare la separazione.
15. Capacità di massa: viene definita anche “carico di massa”; quantità massima di materiale che può essere iniettato in una colonna mantenendo la risoluzione del composto di interesse in maniera adeguata.
16. Gradiente lineare: metodo di separazione cromatografica che modifica la composizione della fase mobile a velocità costante durante un periodo di tempo definito.
17. Ionizzazione: processo mediante il quale una molecola acquisisce una carica negativa o positiva ricevendo o perdendo elettroni per formare degli ioni.
18. Idrofilo: si dissolve o interagisce facilmente con l’acqua o con i solventi polari data la presenza di gruppi polari forti.
19. Equilibrazione: per i metodi cromatografici in cui viene utilizzato un gradiente, il tempo di equilibrazione post-analisi è necessario per riportare la colonna e il sistema alle condizioni iniziali della fase mobile prima dell’iniezione successiva. Per ottenere un’equilibrazione adeguata, la colonna deve essere sottoposta a lavaggio con 5 volte il volume totale della colonna (CV), più 3 volte il volume del sistema (sosta) alle condizioni di partenza del metodo. Gradient Chromatography Column Re-equilibration, Performance PerSPECtives, Waters Corp. 1998 (Riequilibrazione delle colonne per cromatografia a gradiente, Performance PerSPECtives, Waters Corp. 1998). Pendenza del gradiente: velocità di variazione nella composizione del solvente organico per volume di colonna durante una separazione in gradiente.
20. Efficienza misura della capacità di una colonna di resistere alla dispersione di una banda di campione mentre attraversa il letto impaccato. Una colonna efficiente riduce al minimo la dispersione di banda o l’allargamento di banda. Una maggiore efficienza è importante per una separazione efficace, una maggiore sensibilità e/o l’identificazione di componenti simili in una miscela di campioni complessa.
21. Volume di sosta: volume del sistema dal punto di miscelazione dei solventi della fase mobile fino a raggiungere la testa della colonna; per i sistemi LC con miscelazione ad alta pressione, include il miscelatore, il tubo di collegamento e il loop del campionatore automatico come componenti primari, quando i componenti della fase mobile sono miscelati in linea per l’isocratica.
22. Rivelatore: dispositivo che indica una modifica nella composizione dell’eluente misurando proprietà fisiche o chimiche (per esempio assorbanza della luce UV/Visibile, indice di rifrazione differenziale, fluorescenza o conduttività). Alcuni rivelatori (per esempio elettrochimici, spettrometri di massa) sono distruttivi; cioè, effettuano un cambiamento chimico nei componenti del campione. Se un rivelatore è distruttivo per il campione, viene introdotto un divisore per la deviazione.
23. Cromatografia: metodo di separazione in cui i componenti da separare sono distribuiti tra due fasi, una delle quali è statica (la fase stazionaria) mentre l’altra (la fase mobile) si sposta rispetto alla prima.
24. Cromoforo: parte di una molecola che assorbe determinate lunghezze d’onda della luce visibile e ne trasmette o riflette altre. Il cromoforo è una regione della molecola in cui la differenza di energia tra due diversi orbitali molecolari rientra nell’intervallo dello spettro visibile. La luce visibile che colpisce il cromoforo può quindi essere assorbita eccitando un elettrone dal suo stato fondamentale a uno stato eccitato.

RIFERIMENTI

• La cromatografia preparativa è diventata una tecnica inestimabile per la produzione farmaceutica, l’isolamento di prodotti naturali e altre operazioni importanti in cui è richiesta la generazione di materiale purificato. La chiave per utilizzare al meglio la tecnica è direttamente proporzionale alla qualità dello sviluppo del metodo. Una volta che un sistema di purificazione è stato dotato dei componenti hardware e software appropriati per la purificazione su larga scala, il trasferimento del metodo da piccola a larga scala diventa una questione di routine. 
  • Sarker, S., Latif, Z., Gray, A., “Natural Products Isolation” Second Edition. Humana Press. 2006.
  • Aubin, A. “UV-Directed Purification of a Small-Scale Organic Synthesis”, Waters Corporation, Milford, MA USA. 2008.
  • Diehl, D. Fountain, K. Wheat, T. Joblonski, J. Yin, Z. Morrison, D; Collier, S. Murphy, B. Cleary, R. Compagnon, L., “Practical Chemistry Considerations for Purification”. Waters Presentation. 2008.
  • Dolan, J. “A Guide to HPLC and LC-MS Buffer Selection”. Advanced Chromatography Technologies. www.ace-HPLC.com.
  • Jablonski, J et.al. “Effective Use of Temperature Control in Compound Isolation” (Uso efficace del controllo di temperatura per l’isolamento dei composti). Waters Corporation, Milford, MA USA.
  • “At-Column-Dilution, Note applicative”, Waters Corp, 2003.
  • Per maggiori informazioni su Riferimenti e note applicative utili, visitare il sito www.waters.com e inserire i numeri di riferimento blu specifici nella casella di ricerca.