Cromatografía en Fase Reversa

La cromatografía de fase reversa es, con gran diferencia, la técnica de separación por cromatografía líquida más utilizada actualmente en el laboratorio y su popularidad se refleja en la amplia selección de columnas que ofrece Waters en la actualidad.

En su forma más sencilla, en la cromatografía de fase reversa se combinan una fase móvil polar, normalmente una mezcla de agua o solución tampón con eluyentes polares como el metanol, el acetonitrilo o el tetrahidofurano, y una fase estacionaria no polar como hidrocarburos de cadena larga unidos a un soporte de sílice o híbrido. En los últimos años, se ha destinado una gran cantidad de trabajo en los campos de la investigación y el desarrollo al área de las fases estacionarias con el fin de mejorar la eficacia de las columnas y la estabilidad frente al pH y de proporcionar selectividades alternativas.

Las químicas de columnas modernas de Waters se pueden clasificar de manera general en tres categorías:

• Híbrida: diseñada para obtener una estabilidad máxima frente al pH y ofrecer opciones de desarrollo de métodos más flexibles. Disponible en las marcas XBridge™, ACQUITY^® BEH y XTerra^® . Intervalo de pH: 1-12.
• Sílice: históricamente, el soporte de fase reversa más utilizado; los productos SunFire™ y Symmetry^® se sintetizan a partir de materias primas en la fábrica Taunton de Waters y están diseñados para obtener una capacidad de carga máxima. Intervalo de pH: 2-7
• Específica de la aplicación: diseñadas para un área de aplicación específica, como las columnas Atlantis^®, y para obtener una mejor retención de las moléculas polares.

Cromatografía en Fase Normal

Antes del desarrollo de las fases enlazadas de fase reversa, la cromatografía en fase normal era la técnica de separación más popular. Se basa en la interacción de los analitos con grupos funcionales polares de la superficie de la fase estacionaria, que alcanza su potencia máxima cuando se utilizan eluyentes no polares como fase móvil.

La cromatografía en fase normal es una herramienta de separación muy potente debido a la amplia gama de eluyentes disponibles que se pueden utilizar para ajustar con precisión la selectividad de una separación. Sin embargo, muchos cromatografistas han dejado de utilizarla debido a su complejidad. En determinadas circunstancias, existe un período de equilibrado prolongado o problemas de reproducibilidad que se deben principalmente a la sensibilidad de la técnica a la presencia de pequeñas concentraciones de contaminantes polares en la fase móvil. Si estos problemas se controlan, la técnica normalmente proporciona unos cromatogramas mejores a los que se obtienen con los métodos de fase reversa debido a la baja viscosidad de los eluyentes que se utilizan habitualmente.

Las columnas de fase normal están disponibles en las familias de productos SunFire, Nova-Pak y Spherisorb.

HILIC (Cromatografía de Interacción Hidrofílica)

La cromatografía de interacción hidrofílica se ha practicado durante mucho tiempo, aunque el término HILIC se ha empezado a utilizar de forma común recientemente. Los analitos son compuestos muy polares como péptidos, hidratos de carbono o metabolitos polares.

La HILIC se puede considerar una extensión de la cromatografía en fase normal en el ámbito de las fases móviles acuosas. Las fases móviles son mezclas de agua o solución tampón (< 40%) con eluyentes orgánicos. Las fases estacionarias son adsorbentes polares muy hidrofílicos como la sílice, fases enlazadas polares, rellenos poliméricos polares e intercambiadores iónicos. El factor común de todas estas fases estacionarias es que pueden adsorber fácilmente agua , de ahí su clasificación como «hidrofílicas».

Los métodos de gradiente empleados en el modo HILIC son exactamente los opuestos a los que se utilizan en el modo de fase reversa. Las condiciones iniciales comprenden una elevada proporción de eluyente orgánico, normalmente el 95%, y hay un cambio progresivo a una mayor proporción de eluyente acuoso. Por este motivo, también está empezando a ser habitual el término fase reversa-reversa.

La técnica está ganando popularidad y por este motivo se investigan cada vez más rellenos de columnas.

Las columnas HILIC de Waters se encuentran disponibles en las familias de productos Atlantis, XBridge y ACQUITY^®.