Cromatografia in fase inversa

La cromatografia in fase inversa è di gran lunga la tecnica di separazione in cromatografia liquida più utilizzata nei laboratori moderni, e la sua popolarità è confermata dall'ampia scelta di colonne attualmente prodotte da Waters.

Nella sua forma più semplice, la cromatografia in fase inversa comprende una fase mobile polare (solitamente miscele di acqua o tampone con solventi polari come il metanolo, l'acetonitrile o il tetraidrofurano) ed una fase stazionaria non polare come, ad es. un idrocarburo a catena lunga legato ad un supporto di silice o ibrido. Negli ultimi anni si è compiuto molto, nell'ambito della ricerca e dello sviluppo, per quanto concerne i mezzi di separazione allo scopo di migliorare l'efficienza delle colonne, la stabilità al pH e di offrire selettività alternative.

Le moderne fasi stazionarie delle colonne Waters possono essere generalmente classificate in tre categorie:

Fase ibrida: ideata per la massima stabilità al pH, al fine di assicurare le opzioni più flessibili di sviluppo di metodi. Disponibile nelle marche XBridge™, ACQUITY UPLC^® BEH e XTerra^®. Utilizzabili in un intervallo di pH compreso tra 1 e 12.

Fase silice: storicamente, il supporto in fase inversa maggiormente utilizzato. I prodotti della gamma SunFire™ e Symmetry^® vengono sintetizzati da materie prime presso lo stabilimento produttivo di Waters a Taunton e sono progettati per offrire la massima capacità di carico. Utilizzabili in un intervallo di pH compreso tra 2 e 7.

Fase specifica per determinate applicazioni: colonne ideate per una specifica area applicativa come, ad es. la serie Atlantis^® per una migliore ritenzione delle molecole polari.

Cromatografia in fase normale

Prima dello sviluppo delle fasi legate in fase inversa, la cromatografia in fase normale era la tecnica di separazione più comune. Essa si basa sull'interazione tra gli analiti ed i gruppi funzionali polari sulla superficie della fase stazionaria, che è più forte quando la fase mobile è costituita da solventi non polari.

La cromatografia in fase normale è uno strumento di separazione molto efficace per l'ampia gamma di solventi che possono essere utilizzati per ottimizzare la selettività. Molti chimici analitici, tuttavia, non l'apprezzano più a causa di alcune delle complessità che essa comporta. In alcuni casi, infatti, si potrebbero verificare lunghi tempi di equilibrazione o problemi di riproducibilità dovuti soprattutto alla sensibilità della tecnica alla presenza di eventuali contaminati presenti nella fase mobile. Controllando queste problematiche, la tecnica produce, solitamente, cromatogrammi migliori rispetto ai metodi in fase inversa per il basso grado di viscosità dei solventi comunemente utilizzati.

Le colonne in fase normale sono disponibili nelle serie di prodotti SunFire, Nova-Pak e Spherisorb.

HILIC (cromatografia ad interazione idrofilica)

La cromatografia ad interazione idrofilica viene praticata da molto tempo, ma il termine HILIC è diventato di uso comune solo in tempi recenti. Gli analiti sono composti molto polari come, ad es. metaboliti, carboidrati o peptidi.

L'HILIC può essere considerata un'estensione della cromatografia in fase normale nell'ambito delle fasi mobili acquose. Le fasi mobili sono miscele di acqua o tampone (< 40%) con solventi organici. Le fasi stazionarie sono sostanze adsorbenti polari altamente idrofile come le fasi di silice legate polari, gli impaccamenti polimerici polari e gli scambiatori ionici. Il fattore comune a tutte queste fasi stazionarie è che possono facilmente adsorbire l'acqua, da cui la classificazione di “idrofile”.

I metodi del gradiente impiegati in modalità HILIC sono esattamente l'opposto di quelli in modalità in fase inversa. Le condizioni iniziali saranno altamente organiche, solitamente al 95%, per poi diventare progressivamente acquose. Per questa ragione, anche il termine “fase inversa inversa” sta diventando comune.

Poiché la tecnica sta diventando sempre più popolare, è oggetto di crescenti ricerche sugli impaccamenti delle colonne.

Le colonne HILIC Waters sono attualmente disponibili tra le serie di prodotti Atlantis^®, XBridge™ e ACQUITY^®.

Cromatografia a scambio ionico

Nelle separazioni a scambio ionico, la distribuzione e la carica netta sulla superficie della proteina determina l'interazione di quest'ultima con i gruppi dotati di carica elettrica presenti sulla superficie del materiale di impaccamento. Perché l'interazione avvenga, le cariche presenti sulla proteina e quelle presenti sul materiale di impaccamento devono essere di segno opposto. Le variabili che possono essere manipolate, come il pH del tampone, la composizione del tampone, la curva del gradiente ed il gradiente salino offrono un'ampia gamma di opzioni per ottimizzare il processo separativo.

Cromatografia ad esclusione sterica

La dimensione e la forma effettive delle biomolecole in soluzione costituiscono la base per la separazione nella cromatografia ad esclusione sterica. Questo semplice meccanismo di separazione è basato sui seguenti elementi: differenze di dimensione delle biomolecole, materiale di impaccamento, dimensione dei pori, dimensione delle particelle, condizioni di utilizzo (massa e volume del campione), tutti necessari per ottenere una risoluzione ottimale nelle analisi di miscele proteiche. I materiali di impaccamento per cromatografia ad esclusione sterica si sono evoluti, passando dai gel morbidi di polisaccaridi a grandi particelle ai piccoli impaccamenti rigidi che offrono una migliore risoluzione e consentono separazioni significativamente più rapide.

L'esclusione sterica vanta un ampio ambito di applicabilità nell'isolamento delle proteine. È spesso utilizzata per analizzare frazioni, in quanto i tempi di analisi sono relativamente brevi e la tecnica discretamente semplice. La cromatografia ad esclusione sterica può essere utilizzata altresì per lo scambio di tampone, in quanto le molecole di sale a basso peso molecolare vengono facilmente separate dalle proteine molto più grandi.

Cromatografia per affinità

L'affinità è l'unica modalità di analisi cromatografia in cui i biocomponenti (ad es. anticorpi monoclonali o proteine ricombinanti) vengono isolati sulla base della loro interazione biospecifica con un ligando immobilizzato. È possibile ottenere biomolecole caratterizzate da elevata resa di bioattività e buon grado di purezza. Gli impaccamenti per le moderne analisi cromatografiche per affinità sfruttano il vantaggio della rigidità dei materiali di base per ottenere rapide purificazioni di affinità con grandezze espresse in microgrammi e grammi. In un'unica fase è possibile ottenere numerose separazioni che, di conseguenza, risulteranno più convenienti in termini di costi.

Cromatografia per interazione idrofobica

Questa modalità di analisi cromatografia viene utilizzata principalmente, se non quasi esclusivamente, con le proteine legate a una superficie moderatamente idrofobica ad elevata forza ionica. La proteina viene quindi eluita con un gradiente di forza ionica decrescente. La cromatografia per interazione idrofobica offre spesso una buona risoluzione e mantiene l'attività biologica. Nell'interazione idrofobica vengono utilizzati tamponi acquosi. Sono molti i fattori che incidono sulla risoluzione, tra cui concentrazione e tipo di sale del tampone, pH del tampone, tensioattivi, modificatori, temperatura della colonna e funzionalità del materiale di impaccamento. Poiché in condizioni di elevata forza ionica le proteine possono anche interagire tra loro, si ottiene una migliore risoluzione quando il materiale di partenza è già stato parzialmente purificato. Inoltre, non è opportuno caricare grandi volumi di campione ad elevata forza ionica, in quanto ciò indicherebbe che l'interazione idrofobica, nell'ambito di uno schema di isolamento, sarebbe generalmente una valida seconda fase o fase successiva, come quando si verifica la precipitazione di un solfato di ammonio prima del protocollo cromatografico.