分取液体クロマトグラフィーの入門書
はじめに
クロマトグラフィーは、混合物を含有各成分の化学的性質に基づいて分離することと定義されます。分取クロマトグラフィー(精製クロマトグラフィー)は、クロマトグラフィーを使用して化合物をその後の実験やプロセスに十分な量や純度レベルで単離するプロセスと定義されます。まず目的化合物を決定したら、その化合物を原料成分、副生成物、または他の不純物から十分に分離および単離する分析法を開発します。全体的な目的は、ハイスループットと生産性のニーズの高まりに対応し、同時に精製法を適応させて適切なスケール、純度、および再現性の要件を満たすことです。
分取クロマトグラフィーは、大手製薬企業から小規模の天然物研究グループまで数多くの環境で利用されています。アプリケーション領域は異なるかもしれませんが、95%以上の純度レベルで目的化合物の単離が要求される一般的な要件はほぼ共通しています。
本ガイドの目的は、急激に拡大するLC精製分野に関する基礎情報を液体クロマトグラフィー使用者に提供することです。クロマトグラフィー分離法の開発、分析法スケールアップに必要な数式、および一般的に使用されているフラクション分取モードなどの基本原則をご紹介します。大多数の分取LCアプリケーションで使用されている逆相クロマトグラフィーを中心に分離モードを説明します。
液体クロマトグラフィーによる精製
LC分取システムの設備は、フラクションコレクターを追加すること以外、一般的な液体クロマトグラフィーシステムと同じです。サンプル混合液はHPLCカラムに注入され、成分は特定の化学的性質または物理的性質に基づいて分離されます。成分が検出されると、分取容器に回収するか、それとも廃液として捨てるかを選ぶことができます。溶出液の回収方法は、シンプルに成分の溶出に合わせて使用者がマニュアルで分取することも、または完全に自動化して、フラクションコレクターの分取容器へと流路を変えるように検出器がシグナルを送るようにすることもできます。分取容器に回収されたフラクションの純度は、その化合物が分離において近くに溶出するその他の不純物からどの程度分離されるかに左右されます。
図1. 一般的な分取LCシステムの流路
単離精製の成功は、単離され得られた成分のスループット、回収率、および純度により決定されます。単離はピーク分離、つまり「分離能」により決定されます。以下のクロマトグラフィーパラメーターは分離能に非常に大きな影響を与えます:
- カラムケミストリー(固定相)
- 溶媒強度
- 溶媒の種類
- バッファー添加剤
- カラム温度
最適な分離能が得られる条件は、分析法開発ワークフローの実施により決定されます。このワークフローは非常に単純ですが、各サンプルに特異的な性質に基づいて複雑性および必要性に幅のある複数のステップで構成されます。アプリケーションやサンプル分離モード(逆相、イオン交換など)には関係なく、一般的なワークフローは共通です。
図2. 一般的な分取ワークフロー
ワークフローの設計前に検討すべき最も重要な要素は、目的化合物の性質です。既知の化合物をこれまでと同じサンプルまたは新しいサンプルから単離する場合、その目的化合物のクロマトグラフィー挙動に関する文献情報を得るのは比較的簡単で、適切な単離法は過去に発表された分析法から選ぶことができます。しかしながら、化合物の種類が不明なクルードサンプルの単離プロトコールを設計するのはより困難です。このような場合、最初の単離後に一連の予備実験を実施することでpKa、分子量、溶解度、安定性、UVスペクトル、および生物学的活性など目的化合物に関してより多くの情報を得ることができます。この情報に基づいて、目的化合物の化学的要件や物理的要件を満たすよう、最初の分離法を修正することができます。この情報は分析法開発に役立つだけでなく、回収後、単離された化合物の安定性が重要な時にも有用です。
最初のステップでは、サンプルを調製し、高速スカウティンググラジエントを使用して一般的な分離を実施します。一般的には貴重なサンプルを節約するため、小スケールで実施されます。小スケールの分離に基づいて、目的化合物を溶出する溶媒条件を算出し、分離条件をさらに最適化して分離能を最大限にすることができます。高純度の成分を得るのに適切な分離能を維持しながらロードできるサンプル量を決定するために負荷量試験が実施されることもあります。
分離法および必要なサンプル負荷量の確立後、一部例外はあるものの、多くの場合、望まれる成分や潜在的価値のある成分のために分析法スケールアップが実施されます。本ガイドの目的における「スケール」という用語は、アプリケーションの純度、スループット、および収率の目標を達成するのに必要な装置および方法を表すことを意図しています。分析法が「スケールアップ」されると、より高いサンプル負荷量を取り扱うのに適したハードウェアを備えたシステムへと移行します。スケールアップでは基本的に、一連のスケールアップ計算およびハードウェア切替を通して分離能を維持しながら、分析用カラムから分取用カラムに切り替えます。
図3. 分析用および分取用カラム内径の比較
サンプル
特定の化合物を単離するサンプルは、医薬中間体、天然物、栄養補助食品、飲料、または工業製品など由来はさまざまです。出来る限りサンプルを抽出し、溶媒中に溶解させ、クロマトグラフィーを使用して個々の成分に分離、精製します。
サンプル抽出に使用される方法は、抽出するサンプルの複雑性により異なります。天然物の場合、通常、サンプルは乾燥、粉砕し、微粒子にして抽出効率を高めます。次に、サンプルサイズが大きい場合にはパーコレーション、サンプルサイズが小さい場合には浸漬などの方法を使用して目的化合物を抽出します。どちらの方法でも、サンプルに溶媒を添加し、超音波処理、旋回振とう、または浸漬の後に回収します。抽出物の回収後は、すべてのHPLCサンプルと同じく、粒子状物質を除去するためにろ過し、注入前にすべての気泡が除去されていなければなりません。
分離モード
分取クロマトグラフィーで使用される主な分離モードには4つあります。逆相、順相、ゲル浸透、およびイオン交換です。適切な分離モードは、分析対象であるサンプル、抽出物、または混合物と固定相および溶媒との適合性により決定されます。
精製法開発で最も多く使用されている逆相法では、移動相よりも極性の低い固定相が使用されます。移動相は水とアセトニトリルまたはメタノールの混合液を使用することが多く、酸性または塩基性のバッファーはサンプルのイオン化を調整し、固定相表面非修飾の解離型シラノール基と結合させるために添加されます。アルキルシリル化試薬で修飾されたシリカベースのカラムケミストリーは、ピークテーリングを低減し、クロマトグラフィー再現性を高めます。これらの誘導体化試薬(シリル化剤)によるカーボン化率の程度により、さまざまなメーカーが製造したカラムに独自の分離特性を与えることができます¹。
クイックスタート分析法開発
逆相分離法の確立では、多くの場合、将来的なスケールアップを容易にするために、大スケール(直径10mm以上)で使用可能なカラム長と充塡剤を有する小スケールの分析カラム(直径4.6mm以下)を選択します。
最適な分離を達成するには適切な溶媒系を見つけることが重要です。酸性化合物の場合、一般的に水系移動相を酸性pHで調製し、強溶媒としてメタノールまたはアセトニトリルを調製します。濃度0.1%相当のギ酸は、UVと質量分析計の両方に適合性があるため、バッファー添加剤として一般的に使用されています。MS適合性は、未知化合物を特定したり、その後の試験のために精製後の成分を調製したりする場合に役立ちます。塩基性分子を非イオン化型とするには、塩基性pHの移動相を使用することができます。どのようなpHのバッファーを使用する場合もカラムの取扱説明書で適合性を確認してください。
水系移動相は一般的にポンプ位置Aに設置し、強溶媒はポンプ位置Bに設置されます。このガイドでは、ポンプ表において水系移動相と強溶媒をそれぞれ「A」および「B」と呼びます。
