スカウティンググラジエント

スカウティング

複雑な分離に最も影響を与えるのはカラムケミストリーの選択性ですが、分取を目的とした分離法の開発では、高速スカウティンググラジエントで作成したサンプル分離の最適化から始めることが最も効率的です。スカウティンググラジエントの目標は、カラムから目的化合物を溶出するのに必要なおおよその溶媒比率を決定することです。スカウティンググラジエントは通常、同じ強溶媒比率(2~10%)から始めて、直線的に25%、75%、50%、および90~95%まで増加させます。

表1. 高速リニアグラジエントスカウティングの例

図4. 高速リニアスカウティンググラジエントの傾きが緩やかになると、分離能が高くなります²。

スカウティンググラジエントの終了時、次のステップに移る前に一連の確認により結果のレビューと評価を行います:

• 高速リニアスカウティンググラジエントは目的化合物を十分に分離できるか？
• 高速リニアスカウティンググラジエントはスピードや効率が適切か？
• 目的化合物のピークと他のピークの分離は必要なサンプル負荷量において維持できるか？

スカウティンググラジエントで適切な結果が得られない場合、後述するフォーカスグラジエントを用いて最適化するか、その他の方法として分離をpH、溶媒、またはその他のクロマトグラフィー変数全体を修正することができます。

分析法の最適化

目的化合物で最高の分離能が得られるスカウティング分析は、強溶媒および弱溶媒の組成を変更して最適化できます。この組成は、一定に保つアイソクラティックでも、単位時間またはカラムボリュームあたりで変化させるグラジエントでもできます。

アイソクラティック溶出

アイソクラティック分離では、弱溶媒と強溶媒が一定の比率に維持されます。アイソクラティック溶媒は使用者がオフラインで調製することも、異なる溶媒を設定した比率で混合する機能を備えたHPLCポンプを用いてオンラインで混合することもできます。この溶出モードは、システム間で分析法を移管する場合のデュエルボリュームによる保持時間への影響が無視できるレベルであるため、一貫性と頑健性のある使いやすいモードです。

アイソクラティック溶出には弱点があり、すべての分離に適しているわけではありません。特有の問題としては、初期溶出ピークの不十分な分離、ピークテーリングによる対称性の低下、バンドの広がりによる感度の低下、および強力に保持された化合物の蓄積によるカラム汚染の問題などがあります。

グラジエント溶出

逆相またはイオン交換でのグラジエント分離は通常、分析中に有機溶媒を規則的に増やすため、移動相をオンラインで混合します。グラジエントの開始時は溶媒強度が低く、分析種は固定相に分配されるか、カラムヘッドに留まります。溶媒強度の上昇に伴い、分析種は移動相へと移り、カラムの中を通って、最終的に溶出されます。

グラジエント溶出では、妥当な時間枠でさまざまな疎水性を持つ分析種を分離することができます。その他のメリットには、ピーク分離能の向上およびピーク高さの増加による感度の上昇があります。強く保持されている成分が分析終了時にカラムから溶出されるため、カラムの劣化も最小限に抑えられます。

グラジエント溶出を使用する場合には弱点もあります。脈流がない一貫したオンライングラジエント混合が求められるため、多くの場合、高性能なポンプが必要です。また、複数の移動相が特定の組み合わせで混合されると析出の可能性があります。グラジエント後の再平衡化のため実行時間が延長し、また装置間のデュエルボリューム(Vd)のばらつきにより、適切な補正を行わないと分析法移管の問題が発生することがあります。

リニアグラジエント

リニアグラジエントは、実行時間全体を通して強溶媒の組成が一定に増加して進行します。高速スクリーニング実験において目的のピークを溶出する溶媒比を迅速に決定し、実行時間を妥当な時間内に収めて溶出時間を短縮し、時間を短縮するおよび溶媒コストを削減するためによく使用されています。

図5. リニアグラジエントの溶媒プロファイル

セグメントグラジエント

セグメントグラジエントは、傾きが異なるリニアグラジエントの組み合わせです。緩やかな勾配の部分では目的化合物を分離し、急勾配の部分は分離後の洗浄など高い分離能が不要な領域です。

図6. セグメントグラジエントの溶媒プロファイル

フォーカスグラジエント

フォーカスグラジエントは通常、セグメントグラジエントよりも短く、強調されています。一般的に、注入直後は溶媒強度を非常に低くします。その後、目的化合物の溶出に必要な溶媒比よりも2~5%低い割合まで急速に上昇させます(例えば、溶出濃度22%–2%=20%から緩やかなグラジエントを開始)。次に、緩やかなグラジエントは高速スカウティング分離で決定した傾きの約1/5で進み、最終的に目的化合物の溶出濃度よりも2~5%高い割合で終了します(22%+2%=24%で緩やかなグラジエントを終了)。最後に、溶媒の割合を再度急速に上昇させて、カラムに残ったサンプル成分を溶出させます。

フォーカスグラジエントの開発

高速スカウティンググラジエントによるサンプル分析後には、以下の計算を用いて目的化合物のフォーカスグラジエントを作成できます。各等式の後には例を記載します。

まず、スカウティンググラジエントの実行で使用されたシステムのデュエルボリュームを決定しなければなりません。デュエルボリューム決定の手順は、本ガイドの「デュエルボリュームの決定」のセクションまたは www.waters.com/prepcalculator の「分析→分取グラジエントカリキュレーター」アプリケーションツールで確認できます。

また、スカウティングの実行で使用されたカラムのカラムボリュームも決定しなければなりません。カラムボリュームは、シリンダー容量V=πr²hおよび充塡剤が占める容量の補正、つまりV=πr²h(66%)を用いて算出できます。この計算を実施するには「分析→分取グラジエントカリキュレーター」アプリケーションツールも使用できます。

式1: カラムボリューム

式2: グラジエント組成と検出器の間のオフセット容量

式3: 検出器までの時間

式4: ピーク溶出時間

式5: ピーク溶出時の溶媒比率

式6: カラム容積(CV)数

式7: スカウティンググラジエントの傾き

式8: フォーカスグラジエントの傾き

フォーカスグラジエントのセグメントは、溶出すると推定される溶媒比率の5%下から3~5%上までで作成します。例として、ピークが溶出する%を79%とします。

式9: フォーカスグラジエントセグメントの時間の長さ

最終ステップは、以上の式で算出された値を用いてフォーカスグラジエントを書き出すことです。