テクノロジーの実現

流路とハードウェア

SFC分取装置の進歩の結果、SFC分取に関連する課題の多くが克服されました⁷。図7は、SFC分取装置の一般的な流路を示しています。SFCではHPLCと同じ基本流路を使用しており、バイナリーポンプおよびメソッドのコントロール、注入による流路へのサンプル導入、カラムを用いた分離、ピーク検出、およびフラクションコレクターが含まれます。SFCでは、その他にも必要な技術がありますが、それらはほとんどがCO₂の圧縮率および膨張に対処するためのもので、熱交換器(HE)、圧力調整器(BPR)、気液セパレーター(GLS)、および幅広く用いられている高圧ステンレススチールチューブが使用されています。

図7. 一般的な SFC分取システムの流路。類似点を赤色(ポンプ、インジェクター、カラム、検出器、フラクショ ンコレクター)、相違点を青色(ヒーター、圧力調整器(BPR)、および気液セパレーター(GLS))で表示して います。(この流路図はモディファイヤーストリームインジェクションおよびオープンベッドフラクションコレクター で一般的に使用される配管セットアップです)。

各コンポーネントの説明:

送液ポンプ：SFCではLCと同じくバイナリ―ポンプが使用されており、溶媒「A」は必ずCO₂が、メタノールなどの極性有機溶媒は溶媒「B」として送液されます。システムのスケールに応じて、CO₂は2つの方法で送液されます。通常、分析スケールで使用される体積に基づく送液(体積流量)または分取スケールで使用されることの多い質量に基づく送液(質量流量)です。CO₂は圧縮性があるため、密度の差により同一の体積が必ずしも同一の質量に相当するとは限りません。どちらの送液方法も、環境条件にかかわらず、流量に再現性がある限り有用です。ほとんどの場合、CO₂はポンプの前またはポンプヘッド内で冷却され、その後液体として送液されることで、移動相密度の差異を低減します。さらに、すべてのシール、チェックバルブ、チューブ、およびフィッティングは、CO₂でも漏れない高圧に対応でなければなりません。CO₂はいかなる隙間からも容易に膨張するため、わずかな漏れであってもシステム性能やクロマトグラフィーに多大な影響を与えかねません。チューブの漏れ、シール、またはチェックバルブが原因のCO₂の送液不良は、保持時間や選択性の変化だけでなく、圧力(密度)制御不良およびベースラインノイズの原因となる可能性があります。

サンプル注入：一般的に使用される注入モードはミックスストリームおよびモディファイヤーストリームの2種類あり、これらのモードの詳細は「SFCにおける注入方法」のセクションで詳述します。ミックスストリームインジェクションスキームには、サンプルをロードする前にCO₂をループから排気するための減圧ステップがあります。減圧は、ミックスストリームインジェクションとモディファイヤーストリームインジェクションの両方を行うシステムでも安全措置として使われることがあります。通常、これは第二の「排気」バルブで行われます。このセットアップの1つの欠点は注入中にシステムにカラム外ボリュームが追加されてしまい、これはピークの広がりと分離能の低下を引き起こすことがあります。内径が小さなチューブを使用してボリュームを最小限に抑えることで、ピークの広がりは抑えられます。

カラムオーブンおよびカラム加熱：SFCでは、圧力と温度は、移動相密度に影響を与えるため、分離を左右する分析法パラメーターです。そのため、移動相およびカラムの適切な加熱および温度制御が必要です。温度が適切に制御されていない場合、カラム内で発生する温度グラジエントがピーク形状およびピーク分離に有害な影響を及ぼすことがあります。多くのSFCシステムでは、カラムをオーブン内で加熱するか、あらかじめ移動相を加熱するか、またはこの両方の方法を使って、この問題を解決しています。

適切なカラムケミストリー(キラルとアキラル両方)を選択することがSFCでは非常に重要です。したがって、SFCアプリケーションではカラムスクリーニングが必要となります⁷。複数のカラムの中から選ぶため、多くのSFCシステムはオーブン内にカラム切替バルブを備えています。これは、さまざまなカラムケミストリーが必要となる、多数の幅広いサンプルおよびターゲットを精製しているアプリケーションでは特に重要です。

検出器：UV/Vis、PDA、MS、およびELSなど精製で使用される一般的な検出法はすべてSFCと互換性があり、1つのシステム内で複数の検出器を使用することができます。UV/Vis検出器およびPDA検出器は非破壊型検出器であり、一次検出に使用されるため、通常、メイン流路内に接続されます。これらの検出器のフローセルは、SFCで使用される圧力に対して適合している必要があります。MSやELSのような破壊型検出器は、スプリット比を相対制御し、検出シグナルを最適化するために溶媒を調節するスプリッターテクノロジーを用いて接続されます。複数の検出器シグナル(またはチャンネル)を記録することも、フラクショントリガーに使用することもできるため、分析と分取の両方のSFCでテクノロジーのアプリケーション範囲が拡大します。SFCにおけるこれらの検出器の使用については、本章の「SFCにおける光学検出器およびMS検出器」セクションに詳述しています。

圧力調整器(BPR)：あらゆる化合物の溶解度および保持係数は流体密度と密接に関連しているため、カラムに流れる移動相の密度を制御することはSFCにおいて最も重要な要素の1つとなります。密度制御は、主にシステム内の圧力を制御することで達成されます。圧力調整器は、システムのカラム以後の圧力(背圧)を設定した圧力で制御するよう設計された自動装置です。適切で再現性のあるクロマトグラフィーを取得するには、グラジエント条件下や分析間でも、カラム以後の圧力が(設定値において)一定でなければなりません。

CO₂は74bar(約1,073psi)および31°Cを超えると超臨界流体であると見なされますが、この領域における温度や圧力の小さな変化は密度の大きな変化を引き起こすため、臨界点に近い条件で分析することは一般的に推奨されません⁵。そのため、この領域で開発された分析法は保持および分離能に関して堅牢性が低いと考えられます。また、共溶媒が使用されている場合には、低い圧力条件下で、相分離が発生する可能性が高くなるため、ベースラインノイズが発生します。したがって、ほとんどのSFC分析法では、一般的に100bar(1,450psi)以上の、臨界圧力より高い圧力を設定します。

フラクショントリガー：SFC分取では、しきい値、時間および傾きのモード(表3で定義)を使用し、複数の検出器をチャンネルとし、分取のきっかけ(トリガー)にすることができます。分取前に複数の条件を設定し、満たされた時のみ分取を実行するブール論理を使用し、より論理的な分取を行うこともできます。分取の条件には、しきい値と時間などのモードの組み合わせ、またはUVのしきい値とMSなどの検出器シグナルの組み合わせを含めることができます。

表3. SFC分取で使用される分取モードの定義

分取するタイミングの補正も重要であり、目的化合物を最適に分取するには検出器と分取システムとの間の適切な時間補正がされていなければなりません。HPLC分取と同様、このタイミングの補正は流量に依存しています。しかしながらSFCでは、移動相の組成および圧力の変化にも分取タイミングの変化が伴います。メイクアップ溶媒の使用や、CO₂の膨張を抑える他のテクノロジーを使用することで、所定の流量において広範な条件にわたりタイミングを制御することができます。

SFCにおける注入方法

分取のための分離では、大量のサンプルをカラムに導入する必要があります。通常、ピークの広がりとひずみを最小限に抑えるために、サンプル溶解溶媒は移動相と同じであるか、移動相の極性とほぼ同じであることが理想的です。しかし、CO₂を液体状態で取り扱うことは非常に難しいため、SFCにおいては非現実的です。サンプル溶解溶媒をSFC移動相と一致させる試みとしてこれまでに2つの方法が実行されました。1つ目の方法では、サンプルをプレカラムにトラップし、希釈溶媒を中性ガス(通常、窒素)で除去した後、カラム上のサンプルを移動相を使ってスイープしました。2つ目の方法では、SFE(抽出)をSFC分取と直接連結しました。いずれの方法でもサンプル注入量は改善しましたが、全体的な生産性を高めるには時間がかかりすぎるものでした⁶。

現在、SFCアプリケーションにおけるサンプル注入方法にはミックスストリームとモディファイヤーストリームという2つの方法があります(図8の流路図)。ミックスストリームインジェクションでは、すべての移動相(CO₂および共溶媒)がループを通過し、サンプルをカラムに運びます。ミックスストリームインジェクションでよくある問題は、溶解溶媒による強い影響が原因で、ピークがひずんだり、保持時間のシフトが起こることです。標準的な方法は、サンプルを極性モディファイヤー(共溶媒)で溶解することです。メタノールのような強溶媒の使用は、分析種の一部が固定相に吸着されない原因となり、ピークが保持されず溶出したり、ピークのひずみの原因となります。保持時間が短いピークについては、影響がさらに大きく、ひずみがさらに悪化します⁶。注入量が増えると、極性溶媒が移動相の中で局所的な乱れをもたらし、さらに大きなピークのひずみをもたらすだけでなく分離能も低下させます。この注入方法でも減圧が必要であり、これは負荷量および再現性に影響を与えることがあります。ミックスストリームインジェクションでは、CO₂とほぼ同じ極性の溶解溶媒(ヘキサン、ヘプタン、またはその他の非極性溶媒)でピーク形状の改善が確認されています(図9)。

図9. SFCにおいてミックスストリームインジェクションを使用した場合のピーク形状に対するサンプル溶解溶媒強度の影響

2つ目の注入方法はモディファイヤーストリームインジェクションです。この方法では、サンプルはCO₂と混合される前に移動相の有機溶媒部分(共溶媒)に注入されます。これはLC分取システムで使用されるAt-ColumnDilutionスキームとほぼ同じです。その考えは、移動相の全体的な強度に影響を与えずにサンプルを導入し、注入と分析にわたってプログラムされた溶媒の割合を維持することで、溶解溶媒の影響を抑えるということです。この場合、溶解溶媒は分離に使用されている共溶媒と同じ溶媒が良いですが、他の溶解溶媒を使うこともできます。モディファイヤーストリームインジェクションでは、ピーク形状と分離能が向上するため、より多くの注入量とより高い負荷量が実現します(図10)。

共溶媒の割合が低い場合にモディファイヤーストリームインジェクションを使用すると、共溶媒ポンプの流量が低いため、サンプルをカラムへと運ぶ時間が長くなります。移動相は非常に拡散性が高いため、注入時間が長くなることでミックスストリームインジェクションと比べるとピークが広がる可能性があります。それでもピーク形状については、共溶媒の割合が低い場合の大容量のミックスストリームインジェクションと比べると、やや改善されています。ミックスストリームではサンプルをカラムに移動させる時間は短いですが、これらの条件下における乱れの程度はあらゆるメリットを打ち消すものです。共溶媒の割合が上昇すると、注入法の選択はそれほど重要ではなくなりますが、共溶媒の割合が低い場合にはモディファイヤーストリームインジェクションの方がはるかに有利です⁶。

図10. フレーバー化合物2mLの注入(負荷量40mg)を、共溶媒10%の条件においてミックスストリームインジェクション法で行った場合(上)およびモディファイヤーストリームインジェクション法(下)で行った場合

SFCにおける光学検出器およびMS検出器

PDA検出器およびUV/Vis検出器

SFCにおける光学検出器に関しては、SFCに特有の検討事項があります。移動相密度の変化およびCO₂と共溶媒との屈折率の差は、UV/Vis検出器およびPDA検出器においてベースラインドリフトとベースラインノイズを発生させます(図11)。これらの影響はグラジエント条件下では特に顕著です。PDA検出器では、単一波長チャンネルと、ベースラインノイズを抑え感度を向上させる波長補正を使用して、ベースラインを調整することができます(図12)。UV/Vis検出器では、単一波長を設定することでベースラインノイズとベースラインドリフトを目立たなくすることができます。

ハードウェアの観点から、専用フローセルはSFCアプリケーションの高圧に対応するように設計されており、ウォーターズの2998PDA検出器および2489UV/Vis検出器で使用できます。光路長、形状、およびセル材料などのフローセルのデザイン特性は、SFCアプリケーションにおける検出を最適化するために研究されてきました。

図12. 微量ピーク検出のために波長補正を使用した場合(上)および使用しなかった場合(下)のPDA検出器で取得したクロマトグラム

MS検出器

SFCの大きなメリットの1つは、順相の選択性とMS適合性を同時に満たすことです。SFCにおいてCO₂はヘキサンやヘプタンなどのMSに適合しない溶媒の代替になるだけでなく、ガス膨張を介してMSソース内で噴霧と粒子形成に役立ちます。SFCは、さまざまなMS装置におけるESI、APCI、およびデュアルモードの取得に対応しています。特にウォーターズのACQUITYQDa^®検出器は使いやすく、SFC分取で役に立ちます。ただし、共溶媒の割合が低い場合は、最適なシグナル検出に十分なイオンが存在していないことがよくあります。そのため、一般的にはMSにおけるシグナルを強化するためにスプリットからコンディショニング溶媒(またはメイクアップ溶媒)を追加します。一般的なコンディショニング溶媒にはメタノール、水、および添加剤(大抵は水酸化アンモニウムまたはギ酸)の混合物が含まれます。その他にも数多くのコンディショニング溶媒混合物がMS装置の種類、アプリケーションのスケール、あるいは使用者の好みに応じて幅広い流量で使用されます。ウォーターズのACQUITYQDa検出器におけるコンディショニング溶媒を使用した場合と使用しない場合のESI-MS検出の例は図13でご覧いただけます。

図13. SFCにおけるMS検出によるクロマトグラム。上のクロマトグラムはUVトレースで、下は(A)コンディショニング溶媒がない場合のQDaを用いたマスクロマトグラム、および(B)0.6mL/minで95:5メタノール/20mM水酸化アンモニウム水溶液のコンディショニング溶媒を使用した場合のQDaを用いたマスクロマトグラムです。

ELS検出器

SFCはELS検出器にも対応しています。MSと同様、スプリットを使用し、シグナルを向上するためにメイクアップ溶媒を添加します。SFC移動相は非常に揮発性が高いため、サンプルを運び、ELS検出器で良好なシグナルを得るためには追加の溶媒が必要です。ELSDの操作はSFCにおいても、LCとほぼ同じ方法です。

SFC分取におけるフラクション:CO₂ の膨張に対する考慮

膨張する移動相の性質は、SFCで分取制御を検討する際に重要です。31°Cおよび74barの臨界点では、CO₂の大気条件(1barおよび15°C)への体積膨張が約250倍になります。SFC分取システムでは、高圧のCO₂は圧力調整器(BPR)から排出されます。この体積膨張は、排出されるCO₂の圧力が高いほど、大きく増加します。バイナリーシステムでは、一般的なSFC移動相と同じく、CO₂の割合が低下し、有機溶媒の割合が増加すると、膨張が低下します13。膨張が発生すると、溶媒和力の低下およびジュール・トムソン効果による冷却により移動相の溶出力が低下します。この冷却は、チューブを詰まらせる可能性があるドライアイスの形成の原因にもなります。膨張制御が十分でないと、分取流路におけるピークひずみが生じ、フラクション純度が低下します。また、ターゲット化合物が廃液へと押し出されたり、分取時における蒸発により失われたりするため、回収率が低下することもあります。

フラクションの分取を成功させるために、SFC装置ではCO₂膨張とその影響を制御するために数多くの技術が使用されています。まず、冷却とそれに関連する問題を緩和するために、バックプレッシャーレギュレーターの直後、最初の膨張点で移動相を加温します。次に、多くの場合でメイクアップ溶媒が添加されます。この溶媒は化合物を溶液中に保つだけでなく、CO₂の体積割合を減らすことで膨張を制御するのに役に立ちます。膨張を適切に制御することで、BPR後のピーク形状が改善し、回収率が向上します。最後に、CO₂を排気または除去します。一般的に、この目的で高圧サイクロンや気液セパレーター(GLS)などの相分離装置が使用されます(図14)。

高圧サイクロンは、移動相の重い部分(液体)をサイクロンの外側かつ底部に押し出し、CO₂ガスが中央および上部に逃れられるようにします。メリットとして、高圧サイクロンではCO₂の溶媒和力が分取バルブを通して維持され、相分離がサイクロン内で発生するため、(共溶媒の割合が低い場合であっても)メイクアップ溶媒が不要です。しかしながら、いくつかの欠点もあります。高圧分取システムでは、ステンレススチールなどの高耐圧材料が必要で、フラクションの分取に伴う噴霧や膨張により安全性へのリスクが高まります。このような「クローズベッド」システムでは利用可能なフラクションの数が限られているという使用者への制限もあります。気液セパレーター(GLS)は、数多くのメリットのある低圧オプションです。低圧システムでは、定格圧力の低い材料を使用でき、安全性が大幅に向上します。分取時にメイクアップ溶媒が必要となりますが、低圧条件下でより完全にCO₂除去ができ、オープンベッドでの分取が実現するため、分取可能なフラクション数が大幅に増加し、テクノロジーの適用性が広がります。

図14. SFC分取においてCO₂を分離し除去するために使用する高圧サイクロンおよび気液セパレーターの模式図

多様な選択性および適用性

SFC分取は、精製プロセスの選択性を大幅に向上させます。SFCは一般的に順相分離とされていますが、一部のRPLCカラムおよび溶媒を使用することができ、化合物適合性の範囲が広がるため、柔軟性が非常に高くなります。このような広範な選択性を達成できることは、1つのプラットホームの中で補完性のある分離が可能になり、精製プロセス全体が効率化される、SFCの明らかなメリットとなります。

SFCの適合性: 溶解度

基本的に、SFCは順相クロマトグラフィー分離モードです¹⁰。通常の分析条件下では、移動相の大部分は少量の極性有機溶媒と組み合わせた非極性CO₂であり、分離はさまざまな機能を持つ比較的極性が高いカラムケミストリーを充塡した微粒子充塡カラムで行われます。移動相の粘性が低く、カラムに充塡された粒子が小さいため、SFCは主に低分子化合物のアプリケーションで使用されます。しかしながら、SFCを使用した高分子化合物のアプリケーションの範囲も拡大し続けています。その他、化合物がSFCに適しているかどうかは主に溶解度に左右されます。SFCは非常に幅広い溶解度に対応しています。原則的には、有機溶媒に溶解できるサンプルであればSFCを使用できる可能性があります。多くのサンプル調製法では有機溶媒にサンプルを溶解させるため、SFC分取装置に直接注入できます。

有機溶媒中の化合物の溶解度に関して有用な情報の1つは分配係数で、これは一般的にLogPと表されます。一般的には、LogPは化合物の親油性または疎水性の尺度です。具体的には、2種類の非混和性溶媒の平衡状態にある混合物の2つの相における化合物の濃度の比率であり、通常は水と1-オクタノールが使用されます(図15)¹⁴。CO₂は非極性溶媒であるため、LogP値は化合物がSFC条件下でどのような挙動を示すかを正確に表します。LogP値が低いことは極性が高いことを示し、その結果CO₂における溶解度が低下し、極性カラムケミストリーに対する親和性が高まります。一方、LogP値が高いと極性が低く、CO₂に対する溶解度が高まり、カラムへの親和性が低下します。移動相が極性で固定相が非極性のRPLCでは、これと反対のことが当てはまります。

負荷量および濃度がより低いサンプルを扱う分析(UPC²)アプリケーションではLogP値が-2から9の間の化合物に対応できます。ただし、SFC分取など、負荷量が高い状態でCO₂に導入する際には化合物が溶液中に溶解した状態を保つことが重要です。分取用の濃度で量が多くある非常に極性の高い化合物や親水性化合物については、システムへの注入前に溶解度を確認する必要があります。通常、この確認はサンプルを適切な有機溶媒に溶解させ、少量のヘキサンまたはヘプタンを添加して実施されます。サンプルが溶液から析出する場合は、一般的にSFC分取には適していないと見なされます。

SFC分取の欠点の1つは、高極性化合物の溶解度が低いということです。ただし、移動相に含まれる有機溶媒に少量の水(添加剤として、通常5%v:v未満)を加えることで、SFCはさらに広い範囲の極性を持つサンプルに使用できるようになります。水は親水性化合物の溶解度を高め、それらの化合物を分離および精製できるようにします。したがって、SFCの適用性の範囲はペプチド、タンパク質、核酸塩基、およびその他の親水性分析種の研究にまで拡大できます¹⁰。SFCは極性アプリケーションで役に立つことが確認されていますが、SFC分取ではシステム出口でのサンプルの析出や氷の形成を回避するために、利用の際には注意が必要です。

SFCの適用性: 共溶媒

共溶媒の選択は、SFCにおけるクロマトグラフィー分析法開発と最適化のための重要なパラメーターです。順相液体クロマトグラフィーでも逆相液体クロマトグラフィーでも、溶媒混和性には制限があります。順相における脂肪族炭化水素および逆相における水は、これらの分離で使用可能な溶媒の極性範囲を限定します。SFCでは、超臨界CO₂はメタノールからヘプタンまで逆相と順相の両方の有機溶媒に混和できるため、分離法を開発するために幅広い溶媒選択性が実現します(表4)。このような幅広い選択性により、SFC対応アプリケーションの範囲がさらに大きく広がります。

SFCの適用性: カラム

逆相クロマトグラフィーでは、ほとんどの分離が限られた固定相で実施され、一般的にはC₁₈カラムまたは類似した疎水性カラムが使用されます。SFCでは逆相(非極性)と順相(極性)の両範囲に及ぶさまざまなキラルとアキラルのカラムケミストリーが適用可能です(表5)。塩基性、中性および酸性の化合物はほとんどのカラムで溶出されることから、幅広い化学特性に対するSFC分取の適合性が分かります⁷。さまざまなカラムが使用できることは欠点と見なされることもありますが、特定の化合物を精製するために選択性を最適化する機会でもあります⁷。最新のSFC分取カラムケミストリーにより、キラルとアキラルの精製へのSFCの使用が増加する可能性が高まります³。特に、ウォーターズのViridisカラムおよびTorusカラムはSFCアプリケーションに特化して設計されているため、高い安定性、幅広い選択性、および良好なピーク形状を実現し、添加剤の必要性を減らします。表6はSFC分取の適用性範囲に対応するウォーターズのカラムリストです。カラムの選択は分析法開発と最適化のための重要なパラメーターです。

表6. SFCのアプリケーション範囲に対応するウォーターズのカラムケミストリー

キラル分離

SFCはキラル化合物分離のクロマトグラフィーソリューションとしては間違いなく最高のものであり、順相HPLCなどの他のクロマトグラフィー技術と比べると分離の効率とスピードが大幅に改善されています。キラル分離は通常、順相HPLCを使用して実施されます。SFCでは、キラル分離を大幅に短時間で実施できる上、分離能が向上し、溶媒消費量が削減されます。したがってキラルカラムはSFC環境下において多用されており、キラルアプリケーションのみならずジアステレオマー、代謝物、位置異性体、その他の構造類縁化合物の分離にも使用されます⁷。セルロースやアミロースをベースとするカラムケミストリーが最も一般的に使用されていますが、その他のキラルカラムケミストリーにも適合性があります。SFC分取は、上記化合物の精製においてフラクション純度の向上、効率の向上および溶媒使用量削減によるコスト削減などのメリットがあります。図16は順相HPLCとSFCを使用したペルメトリンのエナンチオマーとジアステレオマーのキラル分離です。HPLCでは4つのピークすべてを分離することはできませんでしたが、SFCでは全てのピークを分離できただけではなく、より短いカラムを使用して短時間化にも成功しました¹⁵。

図16. 順相HPLC(A)およびSFC(B)の条件下で取得したペルメトリン立体異性体分離のクロマトグラム¹⁵