分取メソッド開発Q&A
分取メソッド開発の際の疑問点や負荷量を増やすポイントについてQ&A形式でご紹介します。
Q文章をクリックすると内容が表示されます。
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高極性化合物の多くは高比率のアセトニトリルへの溶解が難しく、HILIC条件下でよく使用される初期組成（高比率のアセトニトリル：90-95%）の移動相と適合しないことがあります。特に分取精製においては、注入量が多くなるため溶解溶媒のピーク形状への影響が大きく見られます。
この問題解決のためにウォーターズでは2012年3月にXBridge Amide分取カラムを発売しました。非修飾のシリカやハイブリッドに比べて、アミド結合型固定相のHILICカラムでは極性化合物の保持が強くなることが多く、初期組成移動相のアセトニトリル比率を下げて、水比率を上げた溶解溶媒との適合性向上によるピーク形状の改善が考えられます。
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高極性化合物をC18カラムで十分に保持するためには、100%水系または水リッチな移動相を使用する必要があります。このような移動相では従来のC18カラムで分析を行った場合、突然化合物が保持されなくなることがあります。これは水系移動相下でカラム圧が減少した際にC18の疎水性によりパーティクルの細孔から移動相が排除されてしまい、その結果化合物が保持されない状態で、この現象はDewettingと呼ばれます。Atlantis T3カラムでは官能基密度やエンドキャッピングなどを極性化合物分析のために最適化することで、極性化合物を十分に保持し、100%水系移動相でも安定した保持を実現します。
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最新の高純度シリカを充てんしたSunFireシリカ分取カラムは、Optimum Bed Density(OBD)カラムデザインで優れたピーク形状、高負荷量だけでなく分析カラムとほぼ同等の理論段数、分析カラムからのシームレスなスケールアップを実現し、優れたカラム耐久性および安定性を示します。
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Q4. 分取カラムを選択する際にどの位のサイズを選べばいいのか悩みます。カラムサイズ選択の目安はありますか？
分取カラムサイズは、分析種をどの位の量精製（単離）する必要があるかを基に決定します。下記表は各カラムサイズに対する負荷量の目安となりますが、表中の値はあくまでも"平均的な"概算値です。実際のキャパシティは使用するカラムケミストリや分析種がどういったものかということに加え、分析種の保持やサンプルマトリックス、必要な分離度、希釈溶媒、注入量など多くのファクターが影響を及ぼします。
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Q5. 分析カラムで開発したグラジエントのメソッドを分取カラムにスケールアップしています。きちんと計算しているつもりなのですが、
上手くいかないことがあります。スケールアップする際のポイントなどありますか？
スケールアップに関わる主なファクターとして下記が挙げられます。各項目を確認して適切なスケールアップを行うことが分取メソッド成功の鍵となります。
- カラム（カラムサイズ、粒子径、充てん剤）
- 移動相モディファイア
- 負荷量
- 注入量
- 流速
- グラジエント時間
- イニシャルホールド（システムデュエルボリューム）
適切なカラムを選択してきちんと計算を行っているのに上手くいかない場合、システムデュエルボリュームの違いによるグラジエントのかかりのずれが影響している可能性があります。その場合、イニシャルホールドを設定してシステムデュエルボリュームを補正する必要があります。
（例）
メソッド開発：
- 使用カラム： 4.6×50mmのカラム（カラムボリューム：0.70mL）
- 使用LC装置のシステムデュエルボリューム：0.9mL（実測値）
- システムデュエルボリューム：0.9mL/0.70mL=1.286
- 流速：1.4mL/min
分取メソッド：
- 使用カラム： 19×50mmのカラム（カラムボリューム：11.90mL）
- 使用LC装置のシステムデュエルボリューム：2.6mL（実測値）
- システムデュエルボリューム：2.6mL/11.90mL=0.218
- 流速：23.9mL/min
- システムデュエルボリュームの違い：1.286-0.218=1.068カラムボリューム
- 分取LCで追加するイニシャルホールドボリューム：1.068×11.90mL=12.71mL
- 分取LCで追加するイニシャルホールド時間：12.71ｍL/23.9mL/min=0.53分
使用装置のシステムデュエルボリュームが分かれば、Prepカリキュレータで容易に計算できます。
Prepカリキュレーターはこちらから
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Q6. 手元にあったODSの分析カラムで開発したメソッドを分取にスケールアップしようと思っています。このブランドのカラムには
分取用がないのですが、分取カラム選択する際はどうしたらいいでしょうか？
スケールアップに際して、カラムの選択は重要です。分離選択性を維持してスケールアップするにはなるべく同じ充てん剤を使用したカラム（難しい場合にはなるべく近い選択性のカラム）の選択が望ましく、さらに分析カラム同様の充てん密度をもつ（きっちりと充てんされている）分取カラムを使用することにより理論どおりのスケールアップが可能になります。なるべく近い選択性のカラムを選ぶ目安としては、逆相カラム選択性チャートがご使用いただけます。カラムの疎水性と選択性（塩基性化合物／中性化合物）から数多くのカラムを評価した情報をご提供しており、近い選択性をもつカラムを選ぶ目安となります。
また、ウォーターズの
OBDテクノロジーを採用したカラムでは、分取カラムでも分析カラム同様の充てん密度を実現しています。
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Q7. 今まで分取の移動相の溶媒にはアセトニトリルを使用していましたが、今度メタノールを使用する予定です。何か気をつける点はありますか？
アセトニトリルからメタノールに変更する際のポイントは下記になります。
- 分離選択性の変化
- 溶出力：アセトニトリルに比べて溶出力が弱く分析時間が長くなるため、場合により、有機溶媒混合比の変更、温度を上げる等の検討が必要
- UVカットオフ：アセトニトリルに比べてUVカットオフ値が高いため、UV短波長での分析は難しい
- 粘度：アセトニトリルに比べて粘度が高い
上記項目のうち、分取の場合には粘度は特に重要なポイントとなります。メタノールはアセトニトリルに比べて粘度が高いため背圧が高くなります。特にグラジエント分析においては圧変動が大きく（メタノール濃度が0-50％になると背圧が２倍になり、100％メタノールではイニシャルの背圧よりも低い値になる）、充てん密度の低いカラムではカラム寿命が低減する可能性があります。ウォーターズのOBDテクノロジーを採用したカラムでは、カラム充てんベッド密度の安定性が高く圧変動の影響を最小限にすることができます。
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Q8. 塩基性の化合物を分取することが多いのですが、負荷量があまり増やせず何度も繰り返し分取を行わなければならず非常に時間がかかります。
負荷量を増やすポイントはありますか？
塩基性化合物は一般的によく使用される酸性移動相条件下では解離しており、逆相カラムの保持が弱くなります。特に低濃度のTFAやギ酸などの条件ではすぐにオーバーロードになってピーク形状が悪化するため負荷量が非常に少なくなります。化合物をなるべく分子型にして保持を向上する、または低濃度TFAやギ酸条件下でも塩基性化合物のピーク形状が左右対称でオーバーロードになりにくいカラムを使用することで負荷量を増加できます。
＜Ⅰ 化合物を分子型にして保持向上＞
- Ⅰ-① 塩基性移動相の使用
塩基性移動相を使用することで酸性移動相を使用した場合に比べて負荷量を向上できます。ただし使用するカラムの推奨pH範囲にはご注意下さい。一般的なシリカゲルベースのカラムは塩基性移動相条件下ではカラムの劣化が早くなりますので、アルカリ耐性のカラムの使用が推奨されます。ウォーターズのXBridgeカラムは幅広いpH範囲でご使用でき、塩基性移動相での使用にも最適です。
- Ⅰ-② サンプル溶解溶媒へのアルカリ添加
分取LCでは合成品など溶解度の低いサンプルを分析するため、サンプル溶解溶媒にはDMSOなどの溶解度の高い溶媒が使用されることが多くあります。このような場合、ピークリーディングやブレイクスルーなどの問題が起こり易くなります。塩基性移動相条件に併せ、サンプル溶解溶媒にアルカリを添加して塩基性化合物を分子型にしてロードすることでピーク形状を向上させ更に負荷量を増加させることが可能となります。
＜II 低濃度TFAやギ酸条件下でも塩基性化合物の左右対称なピークが得られるカラムを使用＞
- 表面チャージテクノロジーを採用したカラムの使用
従来の逆相カラムでは低濃度TFAやギ酸条件下では塩基性化合物の負荷量増加に伴いオーバーロードになりフカひれ様ピーク形状を示すため負荷量を増やすことが難しくなります。新規表面チャージテクノロジー（CSHテクノロジー）を採用したXSelectカラムではバランス良い表面チャージによりオーバーロードにならず左右対称なピークが得られるため、負荷量を増加させることができます。表面チャージが過剰になると逆にフロンティングしたピークになります。バランス良い表面チャージを再現性高く結合させ製品化したXSelectの分取カラムでは低濃度TFAやギ酸条件下でも塩基性化合物の高負荷量が実現できます。
同じ基材で異なる表面チャージの3種類のカラム（サイズはどれも4.6x150mm）に強塩基のアミトリプチリンを0.3-1.2μg負荷。移動相：0.05%TFA in 40%アセトニトリル、注入量：20μL、流速:1.0mL/min、カラム温度：30℃、検出：230nm、装置：Alliance2695
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適切なカラムを選択してきちんと計算を行っているのに上手くいかない場合、システムデュエルボリュームの違いによるグラジエントのかかりのずれが影響している可能性があります。その場合、イニシャルホールドを設定してシステムデュエルボリュームを補正する必要があります。
ウォーターズでは合成反応後のクリーンアップ用固相抽出カラムとして
