LCメソッド開発・変更における問題解決Q&A

• Q1. ピークが共溶出して分かれない。分離選択性を変更するには何を変更すればいい？

pH
• 塩基性化合物は酸性条件下では解離するため保持が弱くなりますが、塩基性条件下では分子型となるため保持が強くなります
• 酸性化合物は塩基性条件下では解離するため保持が弱くなりますが、酸性条件下では分子型となるため保持が強くなります

有機溶媒
• アセトニトリル
• メタノール

カラムケミストリ
• 同じ官能基で基材の変更（例： SunFire C₁₈ --> XSelect CSH C₁₈）
• 官能基の種類の変更（例： XSelect CSH C₁₈ --> XSelect CSH Fluoro-Phenyl）
• 逆相カラム選択性チャート を参考にして分離選択性の異なるカラムを選択可能
  *表面チャージハイブリッド（CSH）テクノロジーを採用したACQUITY CSHおよび XSelect CSH HPLCカラム はウォーターズが今までに発売したカラムの中で最も選択性の幅の広いカラムファミリーです。CSHテクノロジーを活用することでより効率的な分析法開発が可能になります。

※上記以外にカラム温度・グラジエント勾配の変更によっても分離選択性を変更できる場合があります。



• Q2. どうしても分離がうまくいかない。移動相など分析条件は変えずに分離選択性を変更したい。

分析条件以外の分離選択性を変更するツールとしてはカラムケミストリがあります。例えば表面チャージハイブリッド（CSH）テクノロジーを採用したACQUITY CSHおよびXSelect CSH HPLCカラムでは、BEH（エチレン架橋型ハイブリッド）の表面に微小レベルのチャージが追加されたことによりイオン解離した分析種に対し同じ官能基でもBEHと異なる選択性を示します。またC18と大きく選択性の異なるFluoro-Phenylをラインアップしているため、カラムケミストリを変更するだけで分離選択性を変えて分離を向上させる可能性がより強く考えられます。

カラムケミストリの違いによる選択性の違い

* S-Value: 選択性相違度の指標。値が大きいほど選択性の違いが大きい


• Q3. ピーク形状・感度がよくない。どうしたらいい①？ ～塩酸リンコマイシンの例～

例)　塩酸リンコマイシンをUSP(米国薬局方)メソッドで分析している

塩酸リコマイシンはpKa7.6の塩基性化合物です。USPメソッドではC8カラム（5µm, 4.6x250mm）を用いてNH₄OH でpH6に調整したH₃PO₄を移動相に使用しますが、pH6は分析種のpKaに近く、良好なピーク形状が得られません。メソッドの頑健性を確保するためには分析種のpKaから±2 pHユニット以上離れたpHで分析することが推奨されます。

より頑健性の高いメソッド開発のためには複数のpH（pH=2,7,12）で確認を行い、ピーク形状・分離度を評価します。





• Q4. ピーク形状・感度がよくない。どうしたらいい②？ ～低濃度ギ酸条件下での塩基性化合物分析～

低濃度ギ酸など酸性低イオン強度の移動相を使用して塩基性化合物を分析した場合、従来のC₁₈カラムではピーク形状が悪く十分な分離・感度が得られないなどの問題がおこります。表面チャージハイブリッド（CSH）テクノロジーを採用したACQUITY CSHや XSelect CSHカラム を使用することで低濃度ギ酸などのLC/MSアプリケーションに最適な移動相で塩基性化合物の良好なピーク形状・ローディングキャパシティを達成し、高分離・高感度が実現します。

0.05%ギ酸でサプレッションなしにTFA相当の分離性能実現


• Q5. 現在のアセトニトリルのメソッドをメタノールに変更したい。有機溶媒比率の変更の目安は？

メタノールはアセトニトリルに比べて溶出力が弱いためそのままの有機溶媒比率で溶出に時間がかかり保持時間が長くなります（化合物・イオン化状態によっては例外もあります）。アセトニトリルとメタノールの溶出力が同じになるように変換するための式も多数計算されています。ウォーターズでは目安として下記の変換チャートをご紹介しています。メタノールへの変更に関してより詳細に説明した 企業内セミナー もご用意しております。



• Q6. 移動相の溶媒をアセトニトリルからメタノールに変更したら分離が悪化した。改善する方法は？

改善する方法としては以下のような方法が考えられます。
• 有機溶媒の濃度の調整
• pHの変更
• カラム（カラムケミストリ）の変更
• グラジエント勾配の変更
• 温度の変更（高温分析）


高温分析
• 全ての分析種で溶出時間が早くなる
• 背圧が下がる
• 共溶出するピークを分離できる可能性
• 分離選択性を変更できる可能性


*高温分析時の注意点
一般的に高温にするとカラムの劣化を加速
特に極端なpH(酸性・アルカリ性)ではさらに劣化を加速 → 高温分析では耐久性の高いカラムの使用が推奨

例えばODSカラムの場合でシリカベースのカラムでは一般的な推奨使用温度は20-45℃
BEH(エチレン架橋型ハイブリッド) のカラムでは推奨使用上限温度は、pH7以下では80℃。pH7以上では60℃。


• Q7. グラジエント分析を行っているが、カラムサイズを変更する場合、グラジエント組成は変更する必要がある？

基本的にはカラムの内径のみ変更した場合には流速をカラムの断面積に比例して変更すれば問題ありません。カラムの長さを変更する場合にはグラジエント時間をカラム長さに比例して変更して下さい。ウォーターズでは、カラムサイズ変更に伴うグラジエント変更に関してより詳細に説明した 企業内セミナー「省溶媒ストラテジー」 もご用意しております。

注：カラムサイズを大きく変更する場合、システムボリュームに対する各カラムボリュームの比に大きな違いが生じるためグラジエントのかかり始めがずれてしまい、イニシャルホールドの設定時間を調整する必要がある場合があります。



• Q8. 高極性～疎水性化合物の一斉分析法開発を行っているが迅速化に苦労している。何か良い方法は？

低官能基密度のC18カラム（Atlantis T3）をご使用ください。 一般的なC18カラムより官能基密度が低いため高極性化合物は強く保持し中性や疎水性化合物は適度に保持します。これにより、比較的シンプルな分析条件で極性～疎水性化合物の迅速一斉分析が可能になります。



• Q9. 現在のHPLCのメソッドをUPLCに変更したい。今と同様の分離選択性のメソッドにしたいが、どのカラムを選択してどうやって移管すれば上手くいく？

HPLC→UPLCへの分析法移管は以下のようなプロセスで容易に行っていただけます。

• 同じまたは近い選択性のカラムを選択
  逆相カラム選択性チャートの活用
• カラムボリュームに比例してグラジエントメソッドを移管
• 必要であればメソッドを一部修正
２と３のプロセスはACQUITY UPLCカラムカリキュレータ（ACQUITY UPLCシステムに付属のソフトウェア)で簡単に計算できます。



*逆相カラム選択性チャートおよびACQUITY UPLCカラムカリキュレータの使用方法に関して セミナー をご用意しております。ご希望の方はご連絡下さい。



• Q10. サンプルが複雑でLCメソッド開発に時間がかかって大変。もっと効率的な方法は？

ウォーターズでは効率的なLCメソッド開発方法として、系統的スカウティングプロトコルを推奨しています。pH、有機溶媒、カラムケミストリといった複数の選択性変更のためのパラメータをスクリーニングできるプロトコルで、複雑なサンプルを効率よく分離できる最も効果的なパラメータの組み合わせを迅速に決定することができます。さらにプロセスに頑健性を組み込んだクロマトグラフィー分析法開発を行うことのできるFusion AE分析法開発ソフトウェアを用いたQuality by Design (QbD)アプローチと組み合わせて頑健性の高い分析法を迅速に開発することができます。分析法開発の詳細について実例を挙げて説明したセミナーもご用意しています。


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