液相色谱初学者指南

液相色谱(LC)是俄国植物学家Mikhail S. Tswett在20世纪初定义的概念。他当时专注于使用填充有颗粒的柱子分离用溶剂从植物中提取的化合物[叶色素]，这是液相色谱史上的先驱性研究。

Tswett用颗粒填充开放式玻璃柱。他发现粉状白垩[碳酸钙]和氧化铝这两种特殊材料对分离有用。他将样品[均质化植物叶子的溶剂提取物]倒入柱中，使样品通过颗粒床。然后使纯溶剂通过。当样品在重力作用下穿过柱子时，可以观察到样品分成了不同颜色的谱带，这是因为某些组分的移动速度快于其他组分。他将这些不同颜色的分离谱带与样品中最初包含的不同化合物联系起来。根据各种化合物对颗粒的化学吸引力强度不同，对这些化合物进行了分析分离。对颗粒有更强吸引的化合物移动速度减慢，而对溶剂有更强吸引的其他化合物移动速度较快。该过程可以描述如下：样品中包含的化合物在称为流动相的移动溶剂与称为固定相的颗粒之间以不同的方式分布或分配。这导致各种化合物以不同的速度移动，从而引起化合物的分离。

Tswett创造了色谱(chromatography)[来自希腊词chroma（意思是颜色）和graph（意思是书写）的组合，即“彩色的书写”）]一词来描述其色彩斑斓的实验。[有趣的是，俄语名字Tswett的意思是颜色。]目前，各种形式的液相色谱已成为分析化学领域的一种强大工具。 

技术2.在图C中，样品以点状形式上样到纸[固定相]上。然后将溶剂[流动相]添加至点的中心，以产生向外的径向流动。这是纸色谱的一种形式。[经典纸色谱的执行方式类似于采用线性流的TLC。]在上图中，将同一黑色FD&C染料样品施涂在纸上。

请注意这种特定纸的分离能力与TLC板相比存在的差异。绿色环表示纸无法将黄色和蓝色染料彼此分开，但可以将这些染料与红色染料分离。在下图中，将由相同的黄色和蓝色染料组成的绿色样品施涂在纸上。与预期结果一样，纸色谱无法将这两种染料分开。在中间的图中，将由红色和蓝色染料组成的紫色样品施涂在纸上。它们得到很好的分离。

技术3.在这个十分强大的方法中，样品通过包含适当颗粒的色谱柱或小柱装置[固定相]。这些颗粒被称为色谱填料。溶剂[流动相]流经该装置。在固相萃取[SPE]中，样品被加载到小柱上，并且溶剂流携带样品通过该装置。与Tswett的实验一样，样品中的化合物随后以不同的行进速度通过装置而得到分离。此处将黑色样品加载到小柱上。在每一步使用不同的溶剂以实现分离。

当使用小柱形式时，可采用多种方式以实现流动。对于设计为不耐压的色谱柱，可使用重力或真空。通常，这种情况下的颗粒直径较大[> 50微米]，因此流动阻力较小。例如开放式玻璃柱[Tswett的实验]。此外，通常呈注射针筒形状的小型塑料柱可以填充填料颗粒并用于样品制备。这称为固相萃取[SPE]。在这种情况下，色谱装置称为小柱，通常使用真空辅助流动，以在进一步分析之前净化非常复杂的样品。

需要较小的粒径[< 10微米]以提升分离能力。然而，小颗粒的流动阻力更大，因此需要施以较高的压力以形成所需的溶剂流速。需要采用专为耐高压而设计的泵和色谱柱。当使用中高压使溶剂流过色谱柱时，该技术被称为HPLC。

什么是高效液相色谱(HPLC)？

已故教授Csaba Horváth在其1970年的Pittcon论文中创造了首字母缩写词HPLC，最初用于指出利用高压产生填充柱液相色谱所需的流速这一事实。一开始，泵的耐压能力仅有500 psi [35 bar]。这被称为高压液相色谱或HPLC。20世纪70年代初，该技术取得了巨大飞跃。这些新型HPLC仪器可以产生高达6,000 psi [400 bar]的压力，并采用改进的进样器、检测器和色谱柱。HPLC在20世纪70年代中后期才真正开始流行起来。在此期间随着性能的不断进步[颗粒更小，压力甚至更高]，这种技术的首字母缩写词“HPLC”保持不变，但名称被改为高效液相色谱。

高效液相色谱法现在是分析化学领域的一种强大的工具。它能够分离、鉴定和定量存在于任何可溶于液体的样品中的化合物。目前，可以轻松鉴定出浓度低至万亿分之一[ppt]级的痕量化合物。HPLC可以并且已经应用于几乎任何样品，例如药品、食品、保健品、化妆品、环境基质、法医学样品和工业化学品。

什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？

2004年，液相色谱的仪器和色谱柱技术取得了进一步发展，在分离度、速度和灵敏度方面实现了显著提升。需要具有更小颗粒[1.7微米]的色谱柱和具有专门功能的仪器，提供15,000 psi [1,000 bar]的流动相，以达到更高的性能水平。必须从整体上创建一套新系统来执行超高效液相色谱（现在称为UPLC技术）。

目前，科学家们正在使用颗粒直径甚至小于1微米的色谱柱以及能够在100,000 psi [6,800 bar]下运行的仪器来从事基础研究。这让我们可以一窥这项技术的未来。