氨基酸水解和分析综合指南

利用液相色谱和光学检测进行氨基酸分析，需要进行额外的样品制备，因为大多数氨基酸缺乏发色团并且无法检测。因此，水解后，氨基酸分析的下一步是衍生化。本节介绍了使用Waters AccQ•Tag化学品制备用于衍生化的蛋白质或肽水解产物。

要正确可靠地衍生化水解样品，必须考虑以下因素：

• 去除颗粒物
• 确定用于衍生化的样品质量
• 确定是否需要中和样品
• 基于样品质量，使用过量的衍生化试剂

基于需要，将简略概述以下讨论。有关AccQ•Tag衍生化学品的更多信息和指导，请访问www.waters.com/AAA。

如果样品中存在大量颗粒物或漂浮的脂质，则可能需要离心处理。离心后，可以更容易地吸出澄清的水解产物等分试样，用于衍生化。

对于饲料分析水解产物等大体积样品，过滤颗粒物即可满足要求，但需要注意，样品回收率可能会受所选过滤材料的影响。为获得无偏差的结果，需要考虑并解决这一影响因素。要了解本应用中过滤器性能的详细信息，请联系过滤器制造商。

AccQ•Tag方法采用柱前衍生化技术，适用于水解肽和蛋白质的氨基酸分析。AccQ•Tag方法能够：

• 使用Waters AccQ•Tag Ultra或AccQ•Fluor试剂对氨基酸进行衍生化处理
• 使用基于梯度的反相HPLC或UPLC分离衍生物
• 使用外部氨基酸标准品和光学检测技术准确定量衍生物

6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)试剂与伯胺和仲胺均可发生反应。过量AQC试剂与水反应可形成6-氨基喹啉(AMQ)。AMQ与过量AQC试剂缓慢反应可形成双脲。这些副产物不会干扰肽或蛋白质水解物中包含的氨基酸的分离、鉴定和定量分析。衍生物可在数天内保持稳定，并可进行批处理或重复分析（如果需要）。

多年来，我们开展了大量研究，目的是确保AccQ•Tag衍生化反应的准确度。化学反应本身需要摩尔量过量的衍生化试剂和碱性pH (8–10)条件才能完全衍生化所有氨基酸。因此，我们针对这些关键挑战制定了策略。

在反应中，通常会将样品稀释10倍，然后进样100 µL总衍生化体积中的1 µL到色谱柱中。在衍生化中，并非所有氨基酸都以相同的含量存在，因此样品量必须过量到足以使其中丰度最低的氨基酸能够影响检测限或定量限。建议在最大进样量为1 µL时，对丰度最低的氨基酸进行至少1 pmol的衍生化处理，以便获得准确的定量结果。为确定所需的样品量，请执行以下计算：

计算示例：
对于样品浓度为1.0 mg/mL的蛋白质：
估算丰度最低的氨基酸所需的样品量。在本示例中，假设需要0.03 mg/mL才能使该氨基酸的色谱柱上进样量达到1 pmol。

将毫克数换算为摩尔量（蛋白质中氨基酸残基的平均分子量为110）。

这是该样品中丰度最低的氨基酸的估计浓度。

在本例中，计算得出稀释倍数为27(10 ÷ 0.37 = 27)。

因此，水解产物在衍生化之前需要稀释27倍。例如：可以将5 µL样品水解产物用135 µL 0.1 N HCl稀释，达到这一目标值。

最后，可以将上述稀释液的10 µL等分试样转移至衍生化样品瓶中。

为确保AccQ•Tag试剂能够完全衍生化水解产物中包含的氨基酸，必须将样品pH范围缓冲至约8.2–10.1。如果酸水解产物未经适当中和且pH值低于8.2，则衍生化将不完全。pH值的影响因各种氨基酸而异。请注意，并非所有氨基酸受到的影响均相同。酸性氨基酸（例如谷氨酸和丙氨酸）比丝氨酸或苯丙氨酸受到的影响更大。pH是准确定量原始样品中所有氨基酸的关键因素。

• 如果氨基酸溶液可溶于0.1 N HCl中，则可以将10–20 µL样品直接转移至衍生化混合物中，而无需调节pH。注：仍然需要确保可用的衍生化试剂过量，如下所述。
• 如果氨基酸溶液中含有较高浓度的酸(>0.1 N HCl)，则应使用等体积、相同浓度的氢氧化钠进行中和。碱溶液可以总体积的形式添加，也可以整合到衍生化步骤中。
  • 使用NaOH替代所需含量的硼酸盐缓冲液，用于中和样品中的HCl。
  • 向衍生化反应样品瓶的混合物中添加10 µL xM NaOH和60 µL硼酸盐。加入10 μL AA样品（在xN HCl中）。用20 µL AccQ•Fluor试剂进行衍生化。
• 如果对适当中和存在疑问，可以制备试验样品并使用一次性pH试纸检查最终pH。

警告：如果样品在加入衍生化试剂后变成亮黄色，则说明样品的pH值过低。请使用NaOH中和。

计算示例：
为确定中和所需的NaOH量，请执行以下计算。
对于以上在6 N HCl中浓度为1.0 mg/mL的蛋白质样品，需要将其稀释27倍，以确保样品中存在足够的过量衍生化试剂，请应用以下计算。

将样品的酸浓度由摩尔浓度换算为微摩尔浓度：

确定稀释后样品中酸的最终浓度：

提醒：可以将5 µL样品水解产物用135 µL 0.1 N HCl稀释，达到这一目标值。

每次衍生化所需的NaOH总量为0.31 M。

用于衍生化的硼酸盐缓冲液的总体积为70 µL，因此可采用两种中和方法：

在每次衍生化时加入10 μL 0.31 M NaOH和60 μL缓冲液。

在单独的样品瓶中，将600 μL硼酸盐缓冲液与100 μL的0.31 M NaOH混合。混合。每份样品为70 µL混合溶液 + 10 µL样品 + 20 µL AccQ•Tag衍生化试剂。

为实现所有氨基酸的完全衍生化，反应中的AccQ•Tag衍生化试剂需要摩尔量过量4–6倍。如果试剂不足，一些相对敏感的氨基酸将无法完全衍生化。各种氨基酸的衍生化率会因氨基酸的化学性质而有所不同；例如，AccQ•Tag的摩尔量过量不足会大幅影响丙氨酸的回收率，而苯丙氨酸则不易受此影响。

为确定要加入到试剂瓶中的样品量，需要清楚每个样品瓶中的试剂量。标准AccQ•Tag试剂瓶中包含3–4 mg试剂，对应于约10–14 µmol试剂。由于该试剂溶于1 mL乙腈中，并且每100 µL衍生化反应使用20 µL试剂，因此每个反应容器中含有210–280 nmol衍生化试剂。

因为每个反应样品瓶中包含210–280 nmol试剂，且每个样品需要摩尔量过量4–6倍，因此每次反应中的胺的总量应不少于40–140 nmol。

计算示例：
对于蛋白质样品，使用样品重量和氨基酸的平均重量来估计所需的过量试剂量。

例如，在蛋白质浓度为1 mg/mL且平均分子量为110的情况下，根据下列公式确定样品中蛋白质的量：

其中，分子量单位从g/mol换算为µg/µmol，并且

    1 mL = 103 µL

    1 mmol = 103 µmol = 106 nmol

一旦摩尔浓度确定，即可计算样品中氨基酸的量。

使用步骤1的1 mg/mL蛋白质，该样品需要稀释27倍（5 µL水解产物储备液 + 135 µL缓冲液）（如第6.3.1节所述），10 µL稀释样品中样品含量(nmol)的计算公式如下：

3.3 nmol远低于140 nmol的限值，因此该样品是可接受的。

沃特世公司于1992年上市的HPLC AccQ•Tag方法使用与AccQ•Tag Ultra方法（2006年推出）相同的柱前衍生化步骤。AccQ•Fluor试剂 - 6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(AQC)可通过一步简单的反应使伯胺和仲胺衍生化，生成高度稳定的荧光加合物。我们将AccQ•Tag方法作为系统包提供，其中包括预填装试剂和大量文档。AccQ•Tag化学品套件中包含的化学品可支持多达250次蛋白质和肽水解产物氨基酸的分析。

AccQ•Tag衍生化试剂盒包含五组衍生化试剂。每组试剂包括以下试剂各一瓶：

• AccQ•Fluor硼酸盐缓冲液 - 加入样品中，确保为衍生化提供理想的pH条件。
• AccQ•Fluor试剂粉末 - 6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)，衍生化试剂（出厂时为干燥状态，以尽可能保持稳定）。
• AccQ•Fluor稀释剂 - 乙腈，用于复溶衍生化所需试剂。

沃特世UPLC氨基酸分析解决方案专为整体氨基酸分析而设计。在Waters ACQUITY UPLC系统上，使用随附的AccQ•Tag Ultra试剂、反相UPLC色谱柱、洗脱液及相应方法，分离柱前衍生的氨基酸。稳定的衍生化学品、稳定的色谱基线和优异的氨基酸分离度有助于确保获得准确、精密且一致的定量结果。

UPLC氨基酸分析解决方案包括：

• Waters AccQ•Tag Ultra化学品（包括色谱柱、试剂和洗脱液） 均在氨基酸分析应用中经过QC测试
• Empower 2软件，预配置项目、方法和报告格式
• 全系统和应用级支持文档

Waters ACQUITY UPLC系统支持三种不同的光学检测器：可变波长UV、PDA和荧光检测器。

UPLC氨基酸分析解决方案包括两种使用相同仪器和化学品的完整方法。第一种方法适用于由蛋白质水解产物衍生得到的氨基酸。第二种方法适用于在细胞培养物或发酵液等处理样品中发现的大量游离氨基酸。这两种方法的不同之处在于AccQ•Tag Ultra洗脱液A的稀释度和分离的柱温。对于洗脱液A或洗脱液B，用户无需调节其pH或改变组分。

蛋白质的氨基酸分析可作为结构测定的一部分，也可以作为样品中蛋白质总量的量度。样品在分析前已经过水解。对于结构分析，将氨基酸观测摩尔比与序列中的预期值进行比较。

对于蛋白质含量分析，将氨基酸的重量相加，作为蛋白质浓度的量度，可在样品组分干扰常见蛋白质分析的情况下用于计算消光系数。利用各种氨基酸的重量百分比和总蛋白质的质量评估食品和饲料的营养成分。沃特世UPLC氨基酸分析解决方案可支持所有这些应用的稳定常规分析。