利用自动化平台简化工作流程：利用Hamilton Microlab STAR进行样品前处理和萃取以准确检测药物

本研究旨在提供一种实用且广泛适用的自动化SPE策略，以准确、可重现地定量分析尿样中的滥用药物和镇痛药物，为法医毒理学的临床研究提供支持。将先前经过验证的方法转移至Hamilton Microlab STAR，除执行完整的SPE程序以外，该平台还执行所有样品预处理工作。这些自动化策略可简化样品前处理工作流程，提高生产率，并降低人为错误的风险，同时确保获得优异的分析性能。

优势

• 自动完成重复任务
• 降低人为错误的风险
• 稳定、可重现的SPE方法
• 使科学家有更多时间执行其他任务

目前，液相色谱与质谱联用系统(LC-MS/MS)是通过单次采集快速分析多种化合物的常用技术。然而，虽然仪器分析取得了进步，但样品前处理仍然可能是限速环节，并且是整个生物分析工作流程中产生错误的来源¹。 由于LC-MS/MS生物分析要求较高的灵敏度、选择性和稳定性，通常选择的样品前处理技术包括简单稀释、蛋白沉淀(PPT)、液液萃取(LLE)、载体液液萃取(SLE)和固相萃取(SPE)。这些方法的开发、优化和实施可能会非常耗时，尤其是分析大型分析物组合时，并且难以在科学家和实验室之间转移。采用全自动装置（如Hamilton Microlab STAR）可简化样品前处理流程，使分析人员有更多时间专注于其他任务。而更重要的可能是降低人为错误几率，例如错误加标、内标添加错误、操作方法不一致以及样品转移错误^2-5。 从而提高分析方法的重现性和一致性。 

本研究旨在提供一种实用且广泛适用的自动化SPE策略，以准确、可重现地定量分析尿样中的滥用药物和镇痛药物，为法医毒理学的临床研究提供支持。将先前经过验证的方法转移至Hamilton Microlab STAR，除执行完整的SPE程序以外，该平台还执行所有样品预处理工作⁶。 这些自动化策略可简化样品前处理工作流程，提高生产率，并降低人为错误的风险，同时确保获得优异的分析性能。

所有标准品均购自Cerilliant（德克萨斯州圆石）和Cayman Chemical（密歇根州安阿伯）。用甲醇配制浓度为2、10和25 µg/mL的混合储备液，具体取决于分析物种类。使用稳定同位素标记的标准品作为内标 (IS)。用甲醇配制浓度为1 μg/mL的内标储备液⁶。 通过将储备液稀释到混合空白尿液中制得样品。 

样品提取

进行固相萃取之前，使用混合空白尿液手动制备所有校准标样和质量控制样品。萃取过程使用的Hamilton Microlab STAR工作台布局和附件如图1所示。另外手动执行提取过程以比较四个QC水平下的准确度和精密度。在预处理过程中，利用STAR液体移取器将100 µL IS加入水解缓冲液，然后将100 µL尿液加入Oasis MCX µElution提取板的各个孔中，通过抽吸混合样品。温育后，利用STAR加入200 µL 4% H₃PO₄，通过抽吸进行混合。在真空条件下将样品上样至STAR工作台的吸附床上，随后用200 µL 20%甲醇水溶液进行清洗。在高真空条件下使吸附剂干燥。用含5%浓氨水溶液(28%～30%)的50:50乙腈:甲醇将样品洗脱两次，每次25 μL。所有样品均用150 µL 97:2:1水:乙腈:甲酸稀释，并在加热摇床中混合3分钟，然后取出进行LC-MS/MS分析。图2为工作流程的详细图示。上文详述的整个自动化SPE过程均提供有易于使用的脚本，可轻松应用于任何Hamilton Microlab STAR或STARlet配置。

以下参数针对特定化合物进行了优化：采集范围、锥孔电压、MRM通道和碰撞能量。这些参数可参见沃特世应用纪要720006187ZH的附录1。

定量分析

执行定量分析之前，先开展分析物回收实验，对手动平台与Hamilton Microlab STAR进行比较，证明经过验证的方法在自动化平台上具有稳定性。两个平台之间的回收率结果相当，因此认为使用自动化样品萃取方法与手动萃取一样有效。

分三天对三批混合尿样进行萃取。绘制两份七点校正曲线，并且重复六次萃取四种不同浓度的质量控制样品。对于大多数化合物，配制浓度为15、75、250和750 ng/mL的质量控制样品，其中较低浓度范围内化合物的浓度为3、15、50和150 ng/mL，较高浓度范围内化合物的浓度为37.5、187.5、625和1875 ng/mL。各化合物的校准范围可参见沃特世应用纪要720006187ZH的表1。各校准品的可接受标准均为目标值±15%，最低浓度点除外，其可接受标准为±20%。质量控制样品的可接受标准为15%范围内，浓度最低的QC样品除外，其可接受标准为目标值的20%范围内。这些标准符合SWGTOX指南⁷和FDA生物分析方法验证要求⁸。三批样品的日间结果总结参见附录1。所有化合物均符合上述标准，且大多数化合物的%RSD低于5%。批次3的日内结果总结参见附录2。所有化合物（除7-氨基氯硝西泮为117%、丁丙诺啡为131%且地西泮为116%以外）均符合标准，且大多数化合物的%RSD均低于5%。所有化合物的R²值均高于0.99。

对比分析

将每个批次中的各个样品萃取两次。每份校准品和质量控制样品均使用Hamilton Microlab STAR处理一份，同时手动处理一份。这样做的目的在于证明自动化平台在执行萃取操作方面的可靠性，其准确度和精密度均在可接受标准的预期范围内。图3展示了手动和自动样品前处理的三个批次中QC 2的结果。手动与自动样品萃取相比，利用STAR分析各化合物获得的准确度和%RSD与手动结果相当，甚至更出色。

使用Hamilton Microlab STAR自动完成尿液中大量滥用药物和镇痛药物的预处理和后续萃取过程，是解决样品制备这一限速环节的有效方法。该解决方案为一系列综合性毒理学化合物组提供了一种简单、快速的SPE过程。将现成脚本与先前经过验证的SPE和分析方法相结合，能够使整个过程快速完成。该全自动样品前处理方法可提供稳定且可重现的定量性能，R²值高于0.99，所有化合物的QC准确度在85%～115%之间（低浓度QC为80%～120%），且大多数化合物的%RSD低于10%。大幅减少了与分析人员相关的错误（例如，分析人员不一致、样品转移、IS添加和标记错误）。使用简单而稳定的全自动样品前处理和SPE方案可实现准确的定量分析。

1. Chapter 5 Automation Tools and Strategies for Bioanalysis, in Progress in Pharmaceutical and Biomedical Analysis, David A. Wells, Editor 2003, Elsevier.p. 135-197.
2. Lehmann, S.; et al.Determination of 74 New Psychoactive Substances in Serum Using Automated In-line Solid-Phase Extraction-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. J. Chromatogr.B. 2017, 1064, 124-138.
3. Wei, D.; et al.Online and Automated Sample Extraction.Bioanalysis 2015, 7 (17), 2227-2233.
4. Zheng, N.; Jiang, H.; Zeng, J. Current Advances and Strategies Towards Fully Automated Sample Preparation for Regulated LC–MS/MS Bioanalysis.Bioanalysis 2014, 6 (18), 2441-2459.
5. Ramírez Fernández, M.d.M.; et al., Validation of an Automated Solid-Phase Extraction Method for the Analysis of 23 Opioids, Cocaine, and Metabolites in Urine with Ultra-Performance Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry.Journal of Analytical Toxicology 2014, 38 (5), 280-288.
6. Danaceau, J. P.; Freeto, S. M.; Calton, L. J. A Comprehensive Method for the Analysis of Pain Management Drugs and Drugs of Abuse Incorporating Simplified, Rapid Mixed-Mode SPE with UPLC-MS/MS for Forensic Toxicology.Waters Application Note, 720006187EN, 2019.
7. Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX) – Recommendations of the Research, Development, Testing, and Evaluation Committee.* Journal of Analytical Toxicology 2013, 37 (3), 187-191.
8. Bansal, S.; DeStefano, A. Key Elements of Bioanalytical Method Validation for Small Molecules.The AAPS Journal 2007, 9 (1), E109-E114.