使用两性离子固定相和液相色谱-串联质谱法分析食品中的氨基糖苷类抗生素

本研究系统地考察了色谱条件（例如，流动相、pH和离子强度或缓冲液浓度）对使用Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱分离17种强极性氨基糖苷类抗生素(AMG)的影响。本研究涉及的AMG包括阿米卡星(AMI)、安普霉素(APR)、庆大霉素（GEN C1、C1a、C2/C2a）、潮霉素B (HYG)、卡那霉素(KAN)、春雷霉素(KAS)、新霉素(NEO)、新霉胺（或新霉素A、NEO A）、巴龙霉素(PAR)、核糖霉素(RIB)、大观霉素(SPC)、链霉素(STP)、双氢链霉素(DSTP)、西索米星(SIS)和妥布霉素(TOB)。使用由20 mM甲酸铵水溶液(pH 3.0)和0.1%甲酸的乙腈溶液组成的二元流动相对这些AMG进行梯度洗脱以实现可靠且充分的分离，并通过电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)发挥优异的灵敏度。使用三氯乙酸溶液萃取食品样品。使用Oasis HLB小柱优化固相萃取(SPE)和净化程序。利用牛奶、牛肉、猪肉、肝脏和蜂蜜样品评估该方法的性能。16种AMG获得了良好的灵敏度、准确度和精密度性能特征，证明最终优化的HILIC-ESI-MS/MS方法可靠、准确且灵敏，适用于测定食品中的AMG。

优势

• 使用Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱可靠地分离17种氨基糖苷类抗生素
• 高灵敏度HILIC-MS/MS方法，满足主要市场的法规要求
• 准确可靠地测定牛奶、肌肉、肝脏和蜂蜜中的AMG
• 兼容MS的流动相，无需使用离子对试剂或高浓度缓冲液

氨基糖苷类抗生素(AMG)是一类重要的抗生素，广泛用于人用药品及兽药中治疗革兰氏阴性菌感染引起的疾病。AMG在畜牧业中的超说明书用药（例如，不遵守治疗后的停药时间）可能导致食品中存在高残留AMG。食品中存在的AMG会对消费者健康构成威胁，因为它们具有毒性和致敏性，并可能导致抗生素耐药性。监测食品中的AMG含量对于确保正确使用AMG以及食品安全至关重要。已经有多个国家/地区和国际组织规定了动物源性食品中的AMG最大残留限量(MRL)（见表1）^1-5。

AMG为水溶性、极性化合物，离子对试剂已成功用于AMG的反相液相色谱分析^6,7。 但是，由于离子对试剂在实际使用中的相关问题，例如平衡缓慢以及可能对其他非离子对应用产生不利影响，这种方法的应用受到限制⁸。 另外也可以使用亲水作用液相色谱法(HILIC)分析AMG，但使用酰胺或氨丙基HILIC固定相时，观察到这些化合物的分离选择性有限⁹。 有研究报道，与酰胺或氨丙基色谱柱相比，两性离子固定相在AMG的分离中表现出更出色的分离度，但某些两性离子HILIC色谱柱需要采用缓冲液浓度较高（高达175 mM）的流动相，这种条件不利于LC-MS分析⁹。

本研究通过电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)法评估了Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱（采用基于BEH颗粒的两性离子磺烷基甜菜碱固定相）分析食品中17种AMG的性能。本研究涉及的AMG包括阿米卡星(AMI)、安普霉素(APR)、庆大霉素（GEN C1、C1a、C2/C2a）、潮霉素B (HYG)、卡那霉素(KAN)、春雷霉素(KAS)、新霉素(NEO)、新霉胺（或新霉素A、NEO A）、巴龙霉素(PAR)、核糖霉素(RIB)、大观霉素(SPC)、链霉素(STP)、双氢链霉素(DSTP)、西索米星(SIS)和妥布霉素(TOB)。这些AMG的结构如图1所示。本研究系统地评估了色谱条件对AMG分离和检测的影响，调整并优化了最初用于STP、DSTP、GEN和NEO的固相萃取和净化程序¹⁰。 利用牛奶、肌肉、肝脏和蜂蜜样品评估了方法性能。 

所有食品样品和AMG标样均在聚丙烯(PP)或塑料容器或实验室器皿中制备。 

化学品与溶液

阿米卡星、潮霉素B、硫酸核糖霉素、硫酸西索米星、硫酸庆大霉素、新霉素三硫酸盐水合物、硫酸妥布霉素和硫酸卡那霉素购自Sigma-Aldrich（美国宾夕法尼亚州阿伦敦）。盐酸新霉胺（或新霉素A）、硫酸安普霉素、盐酸春雷霉素、硫酸链霉素、硫酸巴龙霉素、硫酸双氢链霉素和大观霉素二盐酸盐水合物购自Cayman Chemical（美国密歇根州安娜堡）。GEN由四种组分（GEN C1、C1a、C2和C2a）的混合物组成，GEN C2和C2a为立体异构体。这些AMG的结构如图1所示。

将AMG标准品溶于去离子水(>18.2 Mohm∙cm)中制得标准储备液(1 mg/mL)。混合各标准储备液并用去离子水稀释，制得混合标准工作溶液。所有溶液均盛装于PP容器中，储存在冷冻柜(-20 ^°C)中。使用AMI作为内标(IS)。

制备包含10 mM乙酸铵、0.4 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5%氯化钠和2%三氯乙酸(TCA)的提取溶液，方法如下：称取0.385 g乙酸铵加入500 mL容量瓶中。加入约450 mL去离子水，溶解乙酸铵。用甲酸(FA)试剂将pH调节至4.0后，向容量瓶中加入0.074 g乙二胺四乙酸二钠盐二水合物、2.5 g氯化钠和10 g TCA。充分混合，使固体溶解，加去离子水至刻度。

样品描述

牛奶、肌肉（牛肉和猪肉）、肝脏（家禽）和蜂蜜样品均购自当地商店。本研究还包括蜂蜜，因为蜜蜂细菌感染的治疗会用到AMG。蜂蜜和牛奶样品储存在冰箱(0–4 ^°C)中，肌肉和肝脏样品保存在冷冻柜(-20 ^°C)中。 

样品提取与净化

在50 mL PP离心管中，将3 g蜂蜜、牛奶或捣碎的肌肉或切碎的肝脏组织与20 mL提取溶液混合。将离心管高速(3200 RPM)涡旋2 min，然后在冰箱中放置30 min。将样品再次涡旋混合，并在4 ^°C下以3200 g离心10 min。用塑料移液管定量移取上清液至另一个50 mL PP离心管中。在固相萃取(SPE)和净化之前，采用经校准的pH计，将上清液用碱性溶液（50%和10%氢氧化钾溶液）调节至pH 6.75 ± 0.25。在上样所有上清液（约18 mL）之前，将SPE小柱（Oasis HLB SPE小柱，6 cc Vac小柱，500 mg吸附剂，60 µm，部件号：186000115）用3 mL甲醇和3 mL去离子水活化和平衡。上样后，用3 mL去离子水冲洗小柱，并在真空下干燥15 min。用3 mL洗脱溶液（含10% (v/v)甲酸和5% (v/v)异丙醇的水溶液）洗脱分析物。最终提取物不经任何复溶或稀释，通过LC-MS/MS进行分析。在SPE净化程序中使用沃特世（真空）萃取装置（部件号：186008998）和Otto SPEcialist正压萃取装置（部件号：725000682），二者获得相媲美的结果。使用Oasis PRiME HLB小柱（部件号：186008718）也获得相媲美的结果，且无需活化和平衡步骤。 

1 Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱对AMG的分离效果

流动相含水量、pH和缓冲液浓度是优化Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱对AMG分离效果的主要因素。 

1.1 流动相含水量的影响

图2显示了等度洗脱条件下，流动相含水量对选定AMG在Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱(2.1 × 100 mm, 1.7 μm)上的保留时间(RT)的影响。流动相A为pH 3.0的20 mM甲酸铵水溶液，流动相B为0.1%甲酸的乙腈溶液。图2显示，流动相含水量越高，洗脱速度越快（RT越短）。

1.2 流动相pH的影响

图3显示了梯度洗脱条件下（流动相A在5 min内从20%增加至95%，在95%下保持10 min），流动相A的pH对选定AMG在Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱(2.1 × 100 mm, 1.7 μm)上的RT的影响。流动相A为不同pH的20 mM甲酸铵水溶液，流动相B为0.1%甲酸的乙腈溶液。流速为0.2 mL/min，柱温为40 ^°C。图3显示，后洗脱的AMG表现出更高的pH依赖性。在高pH条件下，AMG（弱碱）离子化率降低，并与固定相具有更强的疏水作用，导致RT更长。峰形、峰强度和分离度也受流动相pH的影响。图4显示了选定AMG在与图3相同的条件下得到的色谱图。随着pH从9降至3，峰（尤其是后洗脱峰）变得更窄、更对称、强度更高且分离度更出色。 

1.3 缓冲液浓度的影响

图5显示了在流速为0.7 mL/min、柱温为50 ^°C的条件下，水性流动相缓冲液（甲酸铵）浓度对选定AMG在Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱(2.1 × 150 mm, 2.5 μm)上的分离效果的影响。流动相A为pH 3.0的各种浓度（5 mM、10 mM、20 mM和40 mM）甲酸铵水溶液，流动相B为0.1%甲酸的乙腈溶液。洗脱程序与实验部分所述相同。在缓冲液浓度为20 mM的条件下获得的峰强度最高。

1.4 其他因素

其他因素（例如柱温和流动相B中的甲酸浓度）对峰强度、峰形和色谱分离度的影响有限。不同粒径（1.7 μm和2.5 μm）的Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱在各种色谱条件（流动相组成、pH、缓冲液浓度等）下表现出相同的趋势。2.5 μm粒径的色谱柱(2.1 × 150 mm)比1.7 μm粒径的色谱柱(2.1 × 100 mm)在相应梯度洗脱条件下(0.2 mL/min)下支持更高的流速(0.7 mL/min，有助于缩短运行时间。最终优化方法采用2.5 µm粒径的色谱柱(2.1 × 150 mm)。 

2. 分析选择性

在空白肌肉样品中发现SPC干扰峰。最初使用的MRM通道为351>98和351>207，其他报告中也使用这些通道⁹。 本研究发现空白肌肉样品在RT 1.62 min处有一个未知峰，与SPC峰(RT 1.56 min)重叠。该未知峰的离子丰度比也与SPC有所不同。为避免该未知峰可能产生的干扰，我们的方法中使用了SPC的备选MRM通道（351>333和333>140），未发现来自空白样品的干扰峰。

此外，还优化了DSTP的MRM通道，以减少同位素取代STP的干扰。STP（分子量581 Da）和DSTP（分子量583 Da）的化学结构相似，并且它们的碎裂模式相同。STP具有与DSTP质量数相同的同位素峰，相对丰度为5.8%（相对于581 m/z处的单同位素峰），该同位素峰会干扰DSTP的定量。DSTP的备选MRM通道涉及同位素取代DSTP的质子加合物（MRM为585>263和586>247），可将STP对DSTP的干扰降至1%以下，同时保持对DSTP具有足够高的灵敏度。难以完全消除STP同位素物质的干扰。 

3. 基质效应

图6显示了AMG的LC-MS/MS分析中的基质效应。本研究利用SPE净化后加标1000 μg/kg标准品的空白样品提取物与SPE洗脱溶液中1000 μg/kg标准品的峰面积比评估了基质效应。在这些AMG中观察到不同程度的基质效应，从强离子抑制（比率低至20%以下）到强离子增强（比率高达170%以上）皆有。AMG定量分析需要进行基质匹配校准。

4. SPE回收率

利用样品前处理开始时加标的空白样品与SPE净化后加标的空白样品的峰面积比计算回收率（见图7）。加标浓度为1000 μg/kg。所有五个样品（蜂蜜、牛奶、牛肉、猪肉和肝脏）中大多数AMG（KAS除外）的回收率在约40%~100%之间，与类似食品基质中报告的结果相当^7,9。 KAS的回收率不佳，这与它的pK_a值较低（pK_a1为3.23）有关，其他AMG的pK_a值均为大约7或更高。KAS以离子化形式存在于SPE上样溶液中（pH调节至6.75 ± 0.25），不会被Oasis HLB吸附剂保留。 

5. LC-MS/MS方法性能特征

本研究利用牛奶、牛肉、肝脏和蜂蜜样品评估了优化后LC-MS/MS方法的性能。各种食品基质的定量限(LOQ)、决定系数(R²)、线性范围、RT和RT精密度见表3。使用以信噪比(S/N)至少为10的低浓度加标（SPE后加标）的空白样品或校准曲线中的最低浓度（以较高者为准）估算LOQ值。这些食品中的LOQ值远低于主要市场中规定的MRL（如表1所示）。使用4–6个浓度水平的基质匹配标准品（SPE后加标）获得R²值，在大多数食品基质中获得了优异的线性(R² > 0.99)。使用溶剂标准品、基质匹配标准品和加标样品获得RT的相对标准偏差（RSD；n = 57，日内精密度），所有AMG均表现出优异的RT重现性（RSD小于1.0%）。图8所示为以2500 g/kg加标的空白牛奶样品中17种AMG的叠加色谱图，最早洗脱的峰(KAS)的容量因子(K')为2.6。

通过测量加标浓度为200 g/kg的空白蜂蜜、牛奶、牛肉、猪肉和肝脏样品评估了方法准确度。准确度计算为实测浓度与加标浓度之间的比率（图9）。使用AMI作为内标。利用加标浓度为1000 g/kg的空白样品作为相应基质中的校准品（单点校准）。图9还展示了5个样品中各AMG的平均准确度和标准偏差(SD)。平均准确度范围为86%~122%，SD范围为4%~23%。这些结果与类似食品基质报告的结果一致^7,9。 本研究分析了8个食品样品，在这些样品中均未检出AMG。

6. 讨论

各种AMG具有相似的结构，难以分离。Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱在优化的色谱条件（包括pH 3.0的20 mM甲酸铵水性流动相）下为17种AMG提供了良好的分离度。其他磺烷基甜菜碱固定相需要明显更高的缓冲液浓度（高达175 mM甲酸铵）⁹，该条件不适用于MS检测。理想缓冲液浓度差异的原因尚不清楚，但据称与BEH颗粒有关，该颗粒与硅胶颗粒相比具有更低的硅醇活性。最终方法中不包括KAS，因为该化合物在SPE过程中未得到充分保留。但是，可以在SPE净化之前使用提取物直接分析。

本研究系统地考察了色谱条件（包括流动相组成、缓冲液浓度和pH）对Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱上AMG分离效果的影响。不同于需要甲酸铵浓度高达175 mM的其他两性离子磺烷基甜菜碱固定相，Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱使用pH 3.0的20 mM甲酸铵水溶液与0.1%甲酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，只需10 min运行时间，17种常用AMG即获得充分分离和优异的灵敏度。Oasis HLB SPE小柱为16种AMG提供了令人满意的净化和回收率。本研究利用牛奶、肌肉、肝脏和蜂蜜样品评估了基于Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱和Oasis HLB小柱的优化后LC-MS/MS方法的性能，所有化合物均获得了优异的灵敏度、良好的准确度和精密度。证明该HILIC-MS/MS方法为筛查和定量食品中的AMG提供了一种良好的解决方案。

1. Tolerances for Residues of New animal Drugs in Food.21 C.F.R. § 556 (2020) Code of Federal Regulations, revised as of April 1, 2020, 21CFR556.网站：https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?CFRPart=556&showFR=1.
2. Commission regulation (EU) No 37/2010 of 22 December 2009 on Pharmacologically Active Substances and Their Classification Regarding Maximum Residue Limits in Foodstuffs of Animal Origin.Official J. European Union L15, 20.1.2010.
3. 《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》(GB 31650-2019), 2019年9月6日发布.2020年4月1日起实施.中国农业农村部.
4. The Japan Food Chemical Research Foundation, Positive List System – Antibiotics.网站：https://www.ffcr.or.jp/en/zanryu/the-japanese-positive/positive-list-system---antibiotics.html.
5. Maximum Residue Limits (MRLs) and Risk Management Recommendations (RMRs) for Residues of Veterinary Drugs in Foods CX/MRL 2-2018, Codex Alimentarius International Food Standards, Food and agriculture Organization of the United Nations, World Health Organization.网站：http://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/codex-texts/dbs/vetdrugs/veterinary-drugs/en/
6. Screening for Aminoglycosides by LC/MS-MS, USDA Food Safety and Inspection Service, Office of Public Health Science, CLG-AMG4.03, effective: Nov 2nd, 2020.
7. Glinka, M., Wojnowski, W., Wasik, A., Determination of Aminoglycoside Antibiotics: Current Status and Future Trends. Trends in Analytical Chemistry 131 (2020) 116034.
8. Dolan, J. Ion pairing – Blessing or Curse? LCGC Europe, 2008; Volume 21, Issue 5, pp 258-263.
9. Díez C, Guillarme D, Staub Spörri A, Cognard E, Ortelli D, Edder P, Rudaz S. Aminoglycoside Analysis in Food of Animal Origin With a Zwitterionic Stationary Phase and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry.Anal Chim Acta.2015; 882:127-39.
10. Young, M.S, van Tran, K., Goh, E., and Shia, J.C., UPLC/MS/MS测定肉类和乳品中的氨基糖苷类抗生素, 沃特世应用纪要 720004512ZH, 2012.