• 应用纪要

免疫亲和色谱净化法结合UPLC分析和荧光检测测定乳汁中的黄曲霉毒素M1

免疫亲和色谱净化法结合UPLC分析和荧光检测测定乳汁中的黄曲霉毒素M1
  • Justine Yu
  • Jianmin Liu
  • Nancy Zabe Collette
  • Simon Hird
  • Waters Corporation
  • VICAM
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摘要

黄曲霉毒素是致癌真菌毒素，会对分别食用受污染食品和饲料的人及动物的健康带来不利影响。黄曲霉毒素M1 (AFM1)是黄曲霉毒素B1 (AFB1)的一种代谢物，动物摄入被AFB1污染的饲料后，在乳汁中发现了AFM1。我们开发出一种高灵敏度、高选择性的方法来测定乳汁中的AFM1。样品前处理包括乳汁离心以及分离和去除脂肪层。然后将脱脂样品上样至VICAM Afla M1免疫亲和色谱(IAC)柱，该色谱柱包含选择性结合AFM1的特异性抗体。AFM1与柱上抗体结合后，冲洗色谱柱以去除基质组分，此时AFM1将从色谱柱上洗脱。使用具有荧光检测功能的ACQUITY超高效液相色谱(UPLC)系统测定AFM1浓度。通过重复分析加标测试部分，评价了该方法的性能。方法检测限为0.005 µg/kg (ppb)。总体回收率令人满意（大于80%），且相对标准偏差低于10%。该方法具有良好的专属性，因为在空白样品中未观察到干扰峰。证明该方法适用于监测全球奶制品是否符合AFM1法规限值的要求。

优势

  • 高性能 - 满足AOAC和欧盟委员会方法性能要求
  • 稳健性 - 由现有AOAC官方方法修改而来
  • 迅速 - 只需要2 mL乳汁，IAC净化速度快，UPLC运行时间短

简介

真菌毒素是有毒的真菌代谢物，会导致牲畜患病或生产效率降低，对人类健康有害并造成经济损失。在食品和动物饲料中，黄曲霉毒素是毒性和致癌性最强的一类常见真菌霉素。乳汁和乳制品可能含有黄曲霉毒素M1 (AFM1)，这是黄曲霉毒素B1 (AFB1)的一种代谢物，而AFB1是一种强效人类致癌物。AFM1存在于产乳动物的乳汁中，此类动物摄入的饲料被AFB1污染，AFB1部分转化为这种羟基化代谢物，然后经乳汁排泄1。 出于多种原因，乳汁和乳制品中的AFM1被报道为全球关切的食品安全问题2。 国际癌症研究机构(IARC)将AFM1归为2B类人类致癌物，AFM1和AFB1的急性毒性相似。AFM1具有热稳定性，正常的加工和储存无法有效降低它在乳汁和乳制品中的含量。如果消费者大量摄入乳品，少量该污染物就有可能引发健康风险，例如儿童，这是一个特别脆弱的消费者亚群。此外，乳汁和乳制品中存在AFM1带来的经济后果会对乳制品生产商造成严重影响。如果产品因不符合黄曲霉毒素标准而在国内或国际市场遭拒，就会产生直接的经济影响。有时，动物饲料中AFB1和乳汁样品中AFM1的含量相对较高，可能对当地消费者的健康构成危害。最近在孟加拉国和巴基斯坦的两次调查中，分别发现71%和48%的样品被AFM1污染2,3。

许多国家/地区对食品（包括乳汁）中的黄曲霉毒素制定了严格规定，具体规定因国家/地区而异。例如，中国、印度、俄罗斯和美国等国家对液态乳品中的AFM1采用0.5 μg/L (ppb)的法典最大推荐限量，而欧盟更为严格，规定乳汁中的AFM1不得超过0.05 μg/kg (ppb)4。 乳汁不仅可作为液态奶直接饮用，还可用于制备婴儿配方奶粉、酸奶、奶酪、奶糖（包括巧克力）和糕点。

监测乳汁和乳制品中的AFM1浓度至关重要，即使在尚未制定食品和饲料污染物法规的国家/地区也是如此。现场检测一般采取基于单克隆抗体选择性的免疫化学试纸检测（如VICAM的Afla M1-V），但实验室检测更倾向于按照官方参考方法使用色谱技术，通常会在分析前进行免疫亲和色谱(IAC)柱净化。高效液相色谱与荧光检测器联用(HPLC-FLD)具有高灵敏度，广泛用于测定食品中的黄曲霉毒素。基于AFM1具有荧光特性，FLD的灵敏度和选择性均高于其他光学检测器，并且不需要通过柱后衍生化增强即可测定其他黄曲霉毒素。

本研究的目的是展示使用VICAM Afla-M1 LC IAC色谱柱和ACQUITY UPLC系统测定乳汁中AFM1的方法性能，该方法根据AOAC官方方法2000.08修改而来5,6。 许多国家/地区已在官方控制中采用该方法（例如印度方法No.FSSAI 07.014:2020）7。

实验

图1显示了黄曲霉毒素分析中的样品提取与净化细节概述。供试品的制备方法为：水浴加热液态奶，然后用磁力搅拌器轻轻搅拌以分散脂肪层，随后离心。丢弃上层脂肪，过滤脱脂奶以备进一步分析。原始AOAC官方方法规定供试品为50 mL脱脂奶，但新方法使用更灵敏的检测器和UPLC仪器，需要的样品量更少，可缩短净化步骤所需的时间。将脱脂奶样品上样到Afla-M1 LC IAC柱上。AFM1与柱上抗体结合。然后用水和甲醇的混合溶液清洗色谱柱以去除色谱柱上的共提取物，再用甲醇洗脱AFM1。随后使用UPLC联合FLD测定提取物中的AFMI。有关Afla-M1 LC IAC柱使用的更多详细信息见此处。

图1.乳汁中AFM1样品前处理和净化的详细信息概述。

使用购自Supelco的10 µg/mL AFM1乙腈溶液（部件号CRM46319）制备校准标准品和加标乳汁样品。使用流动相稀释，制备浓度范围为0.005~2.0 ng/mL的校准标准品。

液相色谱条件

液相色谱系统：

配备FTN样品管理器的ACQUITY UPLC H-Class PLUS

检测条件：

ACQUITY 荧光检测器，配备大体积流通池（部件号：205000609）；激发波长360 nm；发射波长440 nm

样品瓶：

LCGC认证透明玻璃螺纹颈口样品瓶，12 × 32 mm，2 mL（部件号：186000307C）

色谱柱：

ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm, 2.1 x 100 mm（部件号：186009468）

柱温：

25 °C

样品温度：

25 °C

进样体积：

10 µL

流速：

0.4 mL/min

流动相A：

水(68%, v/v)

流动相B：

乙腈(24%, v/v)

流动相C：

甲醇(8%, v/v)

运行时间：

3.5 min

数据管理

色谱软件：

Empower 3

方法验证

通过重复分析加标乳汁样品（之前被视为空白样）验证方法性能。评估以下参数：灵敏度、选择性、线性、正确度和实验室内重现性(RSDr)。通过分析三种浓度的十个重复样确定正确度和重现性；三种浓度分别为预期LOQ (0.005 µg/kg)、欧盟限值(0.05 µg/kg)和包括美国在内的许多其他国家/地区采用的法典限值(0.5 µg/kg)。 

结果与讨论

使用等度条件的HPLC-FLD多年来一直用于AFM1检测。由于亚2 µm颗粒和UPLC系统提高了色谱效率，而且Waters ACQUITY荧光检测器中使用了大体积流通池，因此该方法的定量限非常低。使用等度条件得到的典型UPLC色谱图如图2所示。该色谱方法在3.5分钟内为AFM1提供了出色的保留性和峰形。

图2.分析0.025 ng/mL AFM1标准品的UPLC色谱图

从下方色谱图中峰的信噪比(S/N)可知（图3），该方法的灵敏度出色，适用于检查污染物是否符合全球法规最大限值。据估计，该方法的检测限为0.005 µg/kg或更低。在空白样品中未检测到可能导致误报不合规样品的信号。例如，可以比较图3中的乳汁分析色谱图。

图3.0.005 µg/kg AFM1加标前（上图）和加标后（下图）乳汁分析的UPLC色谱图

使用流动相制备浓度范围为0.005~2.0 ng/mL的4点校准曲线，用于定量AFM1。通过线性拟合得到曲线的决定系数(r2)值为0.9995，表明AFM1的定量结果可靠。

正确度用回收率百分比表示，在80%~114%的范围内；重现性(RSDr)良好，RSD值为9.1%、9.3%和2.4%（见表1）。这些值符合欧盟委员会8和AOAC9规定的要求。

表1.加标实验的样品值以及每个加标浓度下的回收率和重现性总结

结论

研究表明，Afla M1 IAC净化柱可以及时去除乳汁中的潜在干扰，发挥出色的分析物回收率和精密度。ACQUITY UPLC H-Class PLUS选项提供了缩短分析运行时间的可能，通过在荧光检测器中使用大体积流通池可改善灵敏度。该方法可应用于全球各地，具有检查乳汁是否符合AFM1法规限值所需的灵敏度、选择性和整体性能。

参考资料

  1. Koser P et al.The Genetics of Aflatoxin B1 Metabolism.J Biol.Chem. 1988 263: 12584–12595.
  2. Sumon A et al.The Presence of Aflatoxin M1 in Milk and Milk Products in Bangladesh.Toxins 2021, 13:440.
  3. Waqas N et al. Assessment of Aflatoxin B1 in Animal Feed and Aflatoxin M1 in Raw Milk Samples of Different Species of Milking Animals From Punjab, Pakistan.J Food Safety 2021 41(3):e12893.
  4. Turna N and Wu F. Aflatoxin M1 in Milk: A Global Occurrence, Intake, and Exposure Assessment.Trends in Food Science & Technology 2021 110:183–192.
  5. Dragacci S et al.Immunoaffinity Column Cleanup With Liquid Chromatography for Determination of AflatoxinM1 in Liquid Milk: Collaborative Study.J AOAC Int 2001 84(2):437–443.
  6. AOAC Official Method 2000.08-2004.Aflatoxin M1 in Liquid Milk.Immunoaffinity Column by Liquid Chromatography; AOAC International: Rockville, MD, USA, 2004, pp.1–3.
  7. FSSAI.Manual of Methods of Analysis of Foods–Mycotoxins.2020. https://fssai.gov.in/upload/advisories/2020/12/5fca3db8df192Order_Revised_Manual_Mycotoxins_04_12_2020.pdf.
  8. European Union.Commission Regulation (EC) No 401/2006 of 23 February 2006 Laying Down the Methods of Sampling and Analysis for the Official Control of the Levels of Mycotoxins in Foodstuffs.Off.J. Eur.Union 2006, L 70:12–34.
  9. AOAC. Official Methods of Analysis.Appendix F Guidelines for Standard Method Performance Requirements, 2016.

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