• 应用纪要

开发一种分析谷物产品中50种真菌毒素和托烷生物碱的多毒素UPLC-MS/MS方法

开发一种分析谷物产品中50种真菌毒素和托烷生物碱的多毒素UPLC-MS/MS方法
  • Nicola Dreolin
  • Henry Foddy
  • Simon Hird
  • Peter Hancock
  • Timothy Jenkins
  • Waters Corporation
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摘要

本应用纪要介绍了一种多毒素UPLC-MS/MS方法分析谷物产品中50种受管制和新型真菌毒素、阿托品以及东莨菪碱的性能。将Xevo TQ-XS高灵敏度串联四极杆质谱仪与ACQUITY UPLC系统联用，达到了非常低的检测限和定量限。使用简单的“稀释-上样”方案提取混合谷物粉，无需任何净化步骤或内标。使用溶剂标准品和加标提取物（基质匹配校准标样）绘制校准曲线。该方法的检测限和定量限显示，其适用于检查产品是否符合法规限值和调查其他毒素水平。该方法的最低定量限(m-LOQ)是黄曲霉毒素定量限(0.1 µg/kg)。大多数分析物的校准范围均可接受，且覆盖三个数量级。本研究还计算了所有化合物的基质效应，结果显示基质效应较为显著，这说明有必要使用基质匹配标样绘制校准曲线。该方法符合SANTE真菌毒素分析指南中的标准。所得数据导入新版waters_connect定量软件，使用MS Quan应用程序进行处理，提高了数据处理和审查效率。 

优势

  • 使用一种LC-MS/MS方法即可同时测定超过50种真菌毒素和植物毒素
  • 使用高灵敏度Xevo TQ-XS刷新了检测下限纪录
  • 展现出色的灵敏度和良好的线性及重复性，法规要求得以满足
  • MS Quan应用程序与新版waters_connect定量软件减少了处理数据和查看结果耗费的时间

简介

真菌毒素是由多种霉菌天然生成的次生代谢物。这些化合物对人类和动物具有毒性。真菌毒素一般由真菌直接产生，它们的母体结构通常会经真菌本身修饰，释放出许多结构相关化合物的混合物。在感染期间，真菌的宿主植物往往会进一步修饰这些物质。活体植物可能改变毒素的化学结构，产生所谓的“隐蔽型真菌毒素”(masked mycotoxins)。形成隐蔽型毒素是作物的主要解毒策略，因为隐蔽型毒素对植物的毒性较小。为确保食品和饲料安全，许多国家/地区都针对作物中的真菌毒素制定了监管限值。这些法规只涉及一些已知的真菌毒素，如黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1；伏马菌素B1、B2和B3；赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、HT-2毒素、T-2毒素、托烷生物碱和麦角生物碱1。

当前的研究正源源不断地提出有关新型真菌毒素代谢物的各种见解，为适应气候变化而开展的植物育种工作亦是如此。目前人们正在开展风险评估研究，为必要情况下的立法做准备。这些化合物常被称为“新型真菌毒素”2。 “隐蔽型真菌毒素”最初用于指代真菌毒素代谢物的共轭物，不过现在该类型物质已经被更准确地称为“修饰型真菌毒素”，并且包括母体真菌毒素的所有代谢物3。 如今出现新型和修饰型真菌毒素的证据正在迅速增多，这表明此类毒素可能会高频率地（有时甚至还会高浓度地）出现在谷物和其他食品及饲料中4。

其中一些新型和修饰型真菌毒素以及植物毒素已经受到法规监管，未来某个阶段可能还会有更进一步的监管行动。过去十年来，这三种毒素的检测需求大幅增加，其中一部分需求来源于食品/饲料行业的尽职调查，还有一部分是为了回应人们对发生率数据的呼吁。因此，有必要扩大分析的应用范围，纳入这些化合物。本研究扩展了之前一篇应用纪要5的应用范围并探讨了方法扩展后的性能，从而开发出一种使用高灵敏度Xevo TQ-XS分析谷物食品中多种毒素的定量检测方法。

实验

样品萃取

采用基于先前研究的提取程序5,6。 简而言之，将5.0 g均质样品置于50 mL塑料离心管中，然后用20 mL含0.75%乙酸和0.2%甲酸(v/v)的80:20 MeCN:H2O在自动涡旋混合器上提取10 min。在>5000 g的条件下离心6 min后，将150 µL上清液转移到LC样品瓶中，在LC-MS/MS分析之前加入1350 µL水（1:10稀释）并（用玻璃纤维针式过滤器）过滤。总稀释倍数为40。 

校准标样的制备

制备两个校准品系列：

  1. 使用H2O:MeCN 95:5 (v/v)连续稀释混合储备液，制得溶剂标准品。
  2. 使用空白样品提取物连续稀释混合储备液，制得相同浓度范围的基质匹配标准品。

液相色谱条件

色谱系统：

ACQUITY UPLC I-Class PLUS（配备二元溶剂管理器）

自动进样器：

配备15 µL进样针的流通针式进样器(FTN)

色谱柱：

ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 × 100 mm，粒径1.7 µm，孔径130 Å，部件号：186002352）

水性流动相：

1 mM乙酸铵水溶液，含0.5%乙酸和0.1%甲酸(v/v)

有机流动相：

甲醇+ 0.5%乙酸+ 0.1%甲酸(v/v)

洗针液：

水:甲醇:乙腈:异丙醇:丙酮(20:20:20:20:20)+1%甲酸（体积比）

密封清洗溶剂：

水:乙腈(80:20, v/v)

柱温：

40 °C

样品温度：

15 °C

进样体积：

5 µL

流速：

0.40 mL/min
表1.UPLC梯度

质谱条件

质谱系统：

Xevo TQ-XS

电离模式：

ESI+/-（极性切换）

采集模式：

多反应监测(MRM)

毛细管电压：

+0.75/-0.30 kV

电离源补偿：

30 V

锥孔气流速：

200 L/h

脱溶剂气温度：

600 °C

脱溶剂气流速：

1100 L/h

离子源温度：

150 °C

数据采集软件：

MassLynx 4.2版

数据处理软件：

waters_connect定量软件（MS Quan应用程序）

优化后的MRM通道、锥孔电压和碰撞能量见附录。

结果与讨论

色谱分析

除串珠镰孢霉素（保留时间0.71 min）外，所有化合物都有两个MRM通道，且保留时间都在色谱柱死体积所对应保留时间（Vd约为0.55 min）的两倍以上，符合SANTE指南要求7。 串珠镰孢霉素与其他真菌毒素差别很大，由于它是一种强极性的酸性小分子，使用亲水作用色谱(HILIC)来测定它才是确认分析的更优选择。所有分析物的保留时间都很稳定，每个序列内的保留时间变化不超过±0.03 min。

使用之前开发的UPLC方法，几乎所有目标化合物都实现了良好的色谱分离。得益于此，我们在优化MRM采集窗口时得以尽可能减少功能通道重叠，从而尽可能延长驻留时间。良好的色谱峰分离度与高灵敏度的Xevo TQ-XS相结合，使得同一MS方法成功涵盖了50种目标化合物。加标目标化合物的谷物提取物的两幅代表性色谱图如图1所示。

图1.两个不同的加标谷物样品中，各种目标真菌毒素和植物毒素的色谱图。每个峰都根据一条定量离子迹线和一条定性离子迹线进行表征。

灵敏度和定量分析

对应于检测限和定量限的色谱峰分别具有＞3和＞10的信噪比（噪音范围设置：峰到峰，无额外处理）。

分析溶剂标准品时，达到了相当低的仪器检测限(i-LOD)。例如，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1的i-LOD为0.0003 ng/mL。方法定量限(m-LOQ)是指S/N>10且符合校准可接受标准（R2≥0.99且残差≤20%）的最低基质匹配标准品浓度，黄曲霉毒素的定量限低至0.1 µg/kg；赭曲霉毒素、杂色曲霉素、白僵菌素、恩镰孢菌素、阿托品、东莨菪碱和异烟棒曲霉素C的定量限≤1 µg/kg；其余化合物的m-LOQ≤10 µg/kg（雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和青霉震颤素A除外）。表2列出了该方法分析所有50种化合物的灵敏度和定量特征。

表2.评估该LC-MS/MS方法性能的参数概览。RT=保留时间；i-LOD=仪器检测限；m-LOQ=方法定量限；R2=决定系数；ME=基质效应；SE/SS=信号增强或信号抑制因子；加标浓度=为确定重复性而加标到样品中的浓度；RSDr=重复性条件下的相对标准偏差百分比。

大多数分析物的校准曲线覆盖三个数量级。溶剂校准曲线和基质匹配校准曲线的决定系数(R2)几乎都> 0.99，且校准范围仅使用残差百分比低于20%的标准品确定。校准特征的详细信息见表2。

图2显示了以m-LOQ水平加标黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的混合谷物提取物的色谱图。图3显示了相应的基质匹配校准曲线。

图2.分析基质匹配标准品得到的色谱图，图中显示混合谷物提取物中含有黄曲霉毒素B1 (0.1 µg/kg)和赭曲霉毒素A (0.5 µg/kg)。软件算法自动识别出了信号区域（绿色）和噪音区域（黄色）用于计算信噪比。
图3.黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的基质匹配校准曲线以及残差图。

基质效应

按下式计算各分析物的基质效应(%ME)：

其中bM和bS分别是基质匹配校准曲线和溶剂校准曲线的斜率。

信号增强/抑制因子(SE/SS)通过计算bM/bS的比值得到。

基质效应在-100% ~ +83%范围内。信号增强因子介于1.05到1.83之间，信号抑制因子介于0.95到0.005之间。

观察到的基质效应呈现跨数量级的显著变化，由此可确认，使用基质匹配校准曲线对于补偿基质效应和实现可靠定量至关重要。使用13C标记的内标亦可5,6。

基质效应通常是由基质中的共提取物产生的。对于复杂的食品基质，建议采用有效方法净化样品或大幅稀释提取物，以便提高方法稳定性，尽可能减少因仪器维护而导致的仪器停机时间，同时延长色谱柱使用寿命。我们在之前的研究中（部件号：720007377ZH）提出了一套有效的SPE净化方案8。

重复性和鉴定标准

为评估该LC-MS/MS方法的重复性，从小麦、大麦、大米和玉米粉混合而成的样品中取6个试样，加入浓度相当于校准标样#5（见表2）的目标真菌毒素和植物毒素，然后分别提取和分析每个试样。所有分析物的相对标准偏差值(%RSDr) ≤10%。每次分析中，加标试样中所有化合物的离子丰度比和保留时间都与SANTE指南中规定的标准一致7。

结论

该UPLC-MS/MS方法适用于定量检测受管制真菌毒素、受管制托烷生物碱，以及一系列新型和隐蔽型真菌毒素。如果条件允许，建议使用13C标记的内标作为基质匹配校准的替代方法。

得益于Xevo TQ-XS出色的灵敏度，用户可在大幅稀释样品提取物的同时仍达到相当低的定量限。这反过来又减少了对复杂样品制备的需求，并且如本文所述，可以使用简单快速的“稀释-上样”法。尽管如此，净化样品（例如使用Oasis PRiME HLB SPE小柱的直通式SPE净化）仍然是在进样前减少基质共提取物含量的一种选择，有助于提高方法和仪器的稳定性。

有效的UPLC分离与串联四极杆质谱仪的高灵敏度和高选择性相结合，为进一步扩展该方法提供了机会，可以在将来需要时纳入更多的目标分析物。

最后，使用waters_connect作为定量软件尽可能提升了数据处理效率，而且有助于更快地查看和报告定量结果。 

参考资料

  1. Eskola, et al. Worldwide Contamination of Food-Crops With Mycotoxins: Validity of the Widely Cited ‘FAO Estimate’ of 25%. Crit. Rev. Food.Sci.Nutr. 60(16):2773–2789. 2020.
  2. Gruber-Dorninger et al.Emerging Mycotoxins: Beyond Traditionally Determined Food Contaminants.J. Agric.Food Chem. 65(33):7052–7070.2017. 
  3. Freire and Sant’Ana.Modified Mycotoxins: An Updated Review on Their Formation, Detection, Occurrence, and Toxic Effects. Food Chem. Toxicol. 111:189–205.2018.
  4. de Nijs et al. Short Inventory of EU Legislation on Plant Toxins in Food. World Mycotoxin J. 9: 129–139.2017.
  5. Nicola Dreolin, Sara Stead.在Xevo TQ-XS上使用简化的样品制备条件对LC-MS/MS法定量测定谷物粉中的管制真菌毒素进行方法开发与验证.沃特世应用纪要 720006685ZH, 2021年修订.
  6. Nicola Dreolin, Janitha De-Alwis, Dimple D. Shah, Joanne Williams, Sarah Dowd, Nicole Baumgarten, Stuart Adams, Simon Hird. 利用实验室间研究对一种通过LC-MS/MS测定谷物中管制真菌毒素的简单方法进行性能评价.沃特世应用纪要, 720007165ZH, 2021.
  7. SANTE 12089/2016.Guidance Document on Identification of Mycotoxins in Food and Feed. 
  8. Nicola Dreolin, Sara Stead, Simon Hird, Timothy Jenkins.使用直通式SPE和UPLC-MS/MS测定谷物、坚果、无花果和动物饲料中的管制真菌毒素及新型真菌毒素.沃特世应用纪要, 720007377ZH, 2021.

附录

附表3.优化后的目标分析物MRM通道、采样锥孔电压(CV)和碰撞能量(CE)。

特色产品

720007476ZH，2021年12月

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