使用Extraction+互联装置搭配Andrew+™移液机器人进行全自动生物分析固相萃取样品前处理

以下内容介绍Andrew+移液机器人搭配Extraction+互联装置结合小柱和SPE 96孔板，对血浆中的各种药品进行全自动生物分析固相萃取(SPE)以及后续LC-MS检测和分析的能力。

优势

• 使用Andrew+移液机器人和Extraction+互联装置自动绘制校正曲线、生成QC样品和进行固相萃取
• 使用操作简便且可直观查看数据的OneLab™软件创建和传输方法
• 自动化功能与SPE板和小柱兼容
• Extraction+互联装置的真空压力曲线完全可设定，可减少萃取性能的差异性
• 自动化移液和样品前处理可以提高效率，让用户有时间执行其他任务
• 完全“无人值守”自动化，没有用户干预步骤，降低手动失误风险

样品前处理的目的是将目标分析物从基质中分离出来并尽可能地去除干扰物，是生物分析工作流程中相当重要的一环（图1）。为了获得准确、精密且可重现的结果，通常需要一名技术娴熟且富有经验的分析人员，因为在执行样品前处理方案时需要尽可能地减少任何错误或不一致，以避免它们在整个流程中传播。这些错误或不一致可能引起定量不准确，并且可能因重新提取失控批次而导致潜在的时间和资源损失。它们包括生成校正曲线和质量控制(QC)样品时的移液错误、样品漏标或错标、试剂添加错误、分析人员技术相关的不一致和其他可能影响结果的变量。

在生物分析实验室中引入自动化有助于尽可能减少或消除一些错误或不一致，还可以让生物分析科学家有时间执行其他任务。尽管生物分析工作流程的其他环节（如仪器分析、自动采样、数据和结果管理等）在自动化方面有所进展，但由于开发可靠的自动化方案通常需要时间和自动化专业知识，样品前处理往往仍需手动完成。

本应用利用Andrew+移液机器人对血浆中的多种小分子药物生成校正曲线和QC样品。然后再用Andrew+移液机器人(Andrew+)和新型Extraction+互联装置(Extraction+)对制得的样品进行固相萃取(SPE)。Extraction+是一款全新的全自动SPE系统解决方案，与Andrew+搭配使用。Extraction+由一个带“垫圈升降器”和“停放点”（空闲位置）的真空萃取装置、一个可控的真空泵和一个位于装置底座并与外部废液瓶（GL45螺口瓶）相连的废液收集器组成，提供小柱和96孔板规格的完全“无人值守”SPE样品前处理。使用该SPE系统解决方案生成校正曲线和QC样品以及从血浆中萃取分析物可以提供优异的准确度和精密度。所得校正曲线具有优良的精密度(RSD±15%)和线性(>0.99)，质量控制准确度为95.8-107.5%，低、中和高浓度QC的RSD≤5.0%。这些结果完全符合FDA对于小分子LC-MS生物分析性能的建议值。 

材料

所有目标药物均购自Sigma Aldrich。用甲醇制备每种分析物的储备液(1 mg/mL)。用甲醇制备10 mL全部分析物的储备液(100 μg/mL)。大鼠血浆(K₃EDTA)购自Innovative Research。用血浆制备日常工作溶液，用于生成校正曲线和QC样品。对于使用小柱的方案，制备两份校正品，浓度范围5-200 ng/mL。制备QC血浆样品一式三份，浓度分别为10（低浓度QC）、50（中浓度QC）和150（高浓度QC）ng/mL。对于使用96孔SPE板的方案，制备两份校正品，浓度范围5-500 ng/mL。制备QC血浆样品一式三份，浓度分别为20（低浓度QC）、50（中浓度QC）和400（高浓度QC）ng/mL。LC-MS级甲酸和磷酸购自Sigma Aldrich。

自动化平台

Andrew+移液机器人，搭配新型Extraction+互联装置，由基于云的OneLab软件控制，用于设计并执行样品前处理和SPE萃取方案。

SPE萃取

萃取方案

使用Oasis HLB 30 mg萃取板(P/N: WAT058951)或Oasis HLB 1 cc小柱(P/N: 186001879)执行同一反相(RP) SPE萃取方法。上样步骤使用1.0 mL用4%磷酸水溶液1:1稀释的血浆（0.5 mL未稀释血浆）。然后用1 mL 95:5水:甲醇清洗样品，再用2 x 250 µL 100%甲醇洗脱样品，最后用500 µL水稀释。

这些使用生物分析萃取板和小柱进行SPE样品前处理的四个OneLab方案和图示说明见图2-9。每种规格采用一种样品前处理和稀释方案，然后由Andrew+搭配Extraction+执行单独的SPE萃取方案。

LC-MS分析

色谱分离采用Waters ACQUITY UPLC I-Class和ACQUITY UPLC HSS PFP色谱柱(1.8 µm, 2.1 x 50 mm)，使用含0.1%甲酸的水和乙腈流动相进行梯度洗脱。流速设置为0.5 mL/min，柱温设置为35 °C。使用Waters Xevo TQ-XS质谱仪(ESI+)通过单个分析物的多重反应监测(MRM)检测药物分析物。MS检测中对每个分析物选择两个MRM通道（定量通道和确认通道）。表2中列出了每种药物的MS条件。

Extraction+是一种新的全自动SPE系统解决方案，与Andrew+搭配使用，在SPE样品前处理和萃取过程中无需用户干预（图10）。Extraction+互联装置由两个模块组成：精心设计的SPE萃取装置和真空泵，两者都由OneLab软件控制。当搭配Andrew+移液机器人使用时，该装置可以进行液体处理和样品提取，实现完全无人值守的样品前处理。Andrew+移液机器人搭配Extraction+互联装置的主要特点包括：同时兼容萃取板和小柱、流通式废液收集、方案的完全真空控制，最重要的是实现了完全无人值守的自动化。流通式废液收集无需放置和移除废液收集器皿。一体化垫圈升降器将多联器垫圈移动到多联器底座上或从中移出，Andrew+微孔板夹持器用于将收集板或支架上的HPLC样品瓶放置到多联器（活动位置）上。这种组合使提取过程无需任何用户干预。

色谱图

图11所示为此应用所分析化合物的色谱图。它们具有不同的极性范围，这可以从保留时间差异中看出。此外还包括带电和中性化合物的混合物。

样品前处理和SPE小柱/板萃取

Andrew+和OneLab软件能够成功地制备曲线和QC稀释，并使用新的Extraction+功能完全自动化地提取这些制备好的血浆样品。自动混合稀释液确保了性能一致，并体现在定量结果的准确性上。此外还有一些额外优势，包括绝对确定的稀释和样品完整性。只要设定好，就不用担心样品量或试剂添加错误。同样，也没有混淆或调换样品，或者错误地将一批样品全部或部分加标的风险。最后，对真空萃取步骤进行了优化，使样品之间和批次之间保持一致，再次确保了可靠的性能。

定量结果

下面的表2总结了Andrew+制备标样和QC样品，以及随后使用Waters HLB 96孔板和Extraction+萃取血浆样品的定量结果。准确度值的范围为92.1-108.3%。QC结果的精密度也很出色，除一个结果以外，其余结果的%RSD均低于5%。这些结果满足建议的小分子生物分析方法验证限值。分析结果的高精密度证明了Andrew+移液机器人搭配Extraction+装置的样品前处理和SPE自动化的一致性。所选化合物的校正曲线如图12所示。

下面的表3总结了Andrew+制备标样和QC样品，以及随后使用Waters HLB 1 cc小柱和Extraction+互联装置萃取血浆样品的定量结果。准确度值的范围为88.6-110.8%。结果的精密度也很出色，除一个结果以外，其余结果的%RSD均≤5%。同样，这些结果也符合建议的小分子生物分析方法验证准则。所选化合物的校正曲线结果如图13所示。

本应用重点介绍了Andrew+™移液机器人搭配Extraction+互联装置，结合小柱和96孔板进行SPE萃取全自动样品前处理的成功运用。表2和3所示的精确的数据不仅仅证明了移液步骤的准确性和精密度，还证明了使用Extraction+执行的萃取方案的性能。结果相近证明优异的性能与萃取规格（小柱vs.萃取板）无关。Extraction+的一个关键特性是能够使用萃取板或小柱执行全自动SPE萃取，而不需要用户干预。这使得实验室里的科学家可以专注于其他领域，而不是重复的手动任务。

本应用中重点说明的特征和显示的数据表明，Andrew+和Extraction+ SPE系统能够执行完全自动化的标曲样品和QC样品前处理以及不论使用何种萃取实验器皿的SPE。这些功能与直观、基于云的OneLab软件相结合，可以轻松采用实验室自动化，尽可能提高生产力和减少失误，并确保生物分析LC-MS工作流程的整体分析性能。