在胰蛋白酶肽图分析中，使用PeptideWorks™试剂盒通过简单、可自动化的工作流程实现快速、稳定的样品前处理
摘要
本文介绍了一种使用PeptideWorks胰蛋白酶酶解试剂盒进行肽图分析的自动化样品前处理方案。该试剂盒提供了可重现的胰蛋白酶酶解物，是一款专为监管和研究型肽图分析应用而开发的产品。
优势
- 为胰蛋白酶蛋白质酶解物制备提供综合全面的试剂盒和方案，用于质量控制(QC)、生物工艺、分析开发和研究环境
- 可在2.5小时内自动完成24个胰蛋白酶肽图分析样品的前处理
- 可重现地制备胰蛋白酶肽图分析样品，不会影响酶解完成度或产生由方法引起的高水平肽修饰
- 与行业前列的固定化胰蛋白酶酶解试剂盒相比，漏切减少93%，非特异性裂解减少55%
简介
肽图分析可以提供有关生物治疗性蛋白质一级结构的全面信息，在QC、生物工艺、分析开发和研究环境中均有应用1。 通常，我们将供试品的肽图与参比物质的肽图进行比较，因此，样品间重现性对于检测供试品与参比物质之间的实际变化至关重要。可靠的日常样品前处理也是生成有效肽图分析方法的关键因素。肽图分析的样品前处理过程非常复杂。分析之前，要先用碱性缓冲液对蛋白质样品进行高温处理，然后酶解生成肽。这些条件可能导致方法诱导的肽修饰、蛋白质过度酶解或酶解不足以及蛋白水解酶发生自切，并且这些情况均会让数据分析和解读更加复杂。
Waters™ PeptideWorks胰蛋白酶酶解试剂盒为治疗性蛋白质的常规肽图分析提供快速可靠的样品前处理方法。样品前处理试剂盒主要使用RapiZyme™胰蛋白酶，这是沃特世的均匀甲基化重组猪胰蛋白酶。RapiZyme胰蛋白酶具有良好的抗自切性、纯度和高活性，能够加快酶解速度并提高酶解保真度，并且能将胰蛋白酶衍生肽控制在较低水平2,3,4。 高浓度的RapiZyme胰蛋白酶可以加快酶解，而无需高温或牺牲酶解完整性。PeptideWorks工作流程见图1。PeptideWorks试剂盒中使用的试剂和反应条件经过优化，可以通过RapiZyme胰蛋白酶快速完整地酶解蛋白质。
图1.使用PeptideWorks胰蛋白酶酶解试剂盒制备胰蛋白酶蛋白质酶解物的工作流程。该方案可以手动执行，也可以通过Andrew+™移液机器人自动化完成。
实验
试剂制备
NIST单克隆抗体(NISTmAb)参比物质®购自NIST（P/N：8671），Tris HCl（1 M，pH 7.5）购自ThermoFisher Scientific（P/N：15567027），甲酸购自Fisher（P/N：A117-50）。PeptideWorks胰蛋白酶酶解试剂盒（P/N：176005311）中包含了所有其他试剂和所需装置，并已按照PeptideWorks Tryptic Protein Digestion Kit Care and Use Manual（《PeptideWorks胰蛋白酶酶解试剂盒维护和使用手册》，720007980）中所述方案进行制备。
样品前处理
NISTmAb胰蛋白酶酶解物样品的制备包括手动和自动化操作，步骤如下。在配备Extraction+互联设备的Andrew+移液机器人上执行自动化样品前处理。将NISTmAb样品(10 mg/mL)在室温下用含有5 M盐酸胍(GuHCl)和5 mM二硫苏糖醇(DTT)的溶液变性和还原30 min。然后添加碘乙酰胺(IAM)至终浓度为10 mM，并将样品在室温下避光培养30分钟。使用Sep-Pak™ SEC脱盐小柱对样品脱盐，并用酶解缓冲液（10 mM CaCl2和100 mM Tris HCl，pH 7.5）对缓冲液进行置换。使用UV酶标仪测定脱盐样品的浓度，并使用酶解缓冲液作为稀释剂将其归一化为0.1 mg/mL。将RapiZyme胰蛋白酶以1:5的酶:蛋白质比例加入每个样品中，并在37 ºC下酶解30 min。最后，用1%甲酸淬灭反应，最终浓度为0.1%。
液相色谱条件
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液相色谱系统： |
ACQUITY™ UPLC I-Class PLUS |
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样品板： |
Eppendorf 96孔twin.tec® PCR板，带裙边，绿色（P/N：951020443） |
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色谱柱： |
ACQUITY Premier CSH™ C18肽分析专用柱, 1.7 µm, 2.1 × 150 mm（P/N：186009489） |
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柱温： |
65 °C |
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样品温度： |
6 °C |
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进样体积： |
10 µL |
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流动相A： |
0.1%甲酸水溶液 |
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流动相B： |
0.1%甲酸的乙腈溶液 |
梯度表
ACQUITY RDa检测器设置
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质量范围： |
50~2000 m/z |
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模式： |
包括碎片的全扫描 |
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电离模式： |
ESI+ |
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采样速率： |
2 Hz |
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锥孔电压： |
20 V |
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碎裂锥孔电压： |
60–120 V |
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脱溶剂气温度： |
350 °C |
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毛细管电压： |
1.20 kV |
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实时质量校正标样： |
waters_connect™实时校正标准液 |
数据管理
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色谱软件： |
waters_connect |
结果与讨论
PeptideWorks工作流程
PeptideWorks工作流程经过优化，能够使用RapiZyme胰蛋白酶快速完整地酶解蛋白质。该工作流程可以手动执行，也可以通过Andrew+移液机器人自动化完成；手动和自动化工作流程的步骤均按照图2中所述。
图2. PeptideWorks样品前处理工作流程图。手动和自动样品前处理均遵循所示工作流程。
自动化PeptideWorks工作流程分为两个方案：方案A执行变性、还原和烷基化，方案B执行浓度归一化和酶解。自动化工作流程最多可处理24个样品。完整的24样品工作流程的工作台布局如图3所示。虽然建议进行浓度归一化以确保酶解过程中的酶:蛋白质比例准确，但本研究还开发了一种未经浓度归一化的自动化工作流程。24个样品的总执行时间采用浓度归一化方法为2 h 40 min，未采用浓度归一化方法则为2 h 30 min。
图3.24样品自动化PeptideWorks工作流程的工作台布局。方案A执行变性、还原和烷基化，方案B执行浓度归一化和酶解。
手动和自动化样品前处理对比
使用PeptideWorks胰蛋白酶酶解试剂盒，分别通过手动和Andrew+移液机器人自动化方式来酶解NISTmAb。通过UPLC-MS分析NISTmAb酶解物；使用手动和自动化PeptideWorks工作流程制备的NISTmAb酶解物的色谱图如图4所示。手动和自动化样品前处理方法均得到相当的色谱结果，且序列覆盖率较高（预期肽段>88%）。此外，手动和自动化样品前处理工作流程中修饰肽的相对丰度一致，如下文所述。
图4.使用手动和自动化PeptideWorks工作流程制备的NISTmAb酶解物的BPI色谱图，结果相当。
色谱数据在waters_connect中使用肽图分析工作流程进行处理。漏切和非特异性裂解的相对水平使用已发表的方法计算5。 图5显示了使用手动和自动化PeptideWorks工作流程制备NISTmAb酶解物的相对漏切和非特异性裂解结果。两种PeptideWorks工作流程制备而成的NISTmAb酶解物的漏切和非特异性裂解均低于5%，表明酶解效率高，不会发生蛋白质过度酶解。使用成熟的固定化胰蛋白酶酶解试剂盒制备NISTmAb酶解物的漏切和非特异性裂解结果基于已发表的结果，在图5中以红色显示6。 与固定化胰蛋白酶酶解试剂盒相比，PeptideWorks将漏切减少93%，非特异性裂解减少55%。总体而言，PeptideWorks提供了更彻底、特异性更强的酶解过程，提高了可靠性并加快了数据处理速度。
图5.NISTmAb酶解物的漏切和非特异性酶切的相对丰度，酶解物分别使用手动和自动PeptideWorks工作流程以及行业前列的固定化胰蛋白酶试剂盒制备而成。条柱代表标准偏差。PeptideWorks可实现更彻底、特异性更强的酶解过程。
肽修饰表征和重现性
使用自动化PeptideWorks工作流程在三天内制备三批NISTmAb酶解物，选定肽修饰的相对丰度如图6所示；还展示了手动工作流程制备NISTmAb酶解物的结果，以证明手动和自动样品前处理之间的一致性。图6中报告的值完全在已发表的NISTmAb胰蛋白酶酶解物数据的范围内6-9。 本文报道的修饰值与文献发表结果相一致，这印证了PeptideWorks的有效性。PeptideWorks能够快速制备胰蛋白酶肽图分析样品，不会影响酶解完成度，也不会导致方法引起的高水平脱酰胺或氧化。
未修饰肽丰度和修饰肽相对丰度的变异性（以相对标准偏差(RSD)表示）详见图6中的表格。每种肽未经修饰的肽丰度的日间差异小于15%，表明使用PeptideWorks进行样品前处理时肽回收率一致，因此定量限一致。对于每种肽修饰，修饰肽的相对丰度的日间差异小于10%。
图6.左：使用自动化PeptideWorks工作流程制备三批NISTmAb酶解物的选定肽修饰相对丰度柱形图。图中还展示了使用手动工作流程制备的NISTmAb酶解物结果，以此证明手动和自动化样品前处理之间的一致性。条柱代表标准偏差。右：表中列出了未修饰肽丰度和修饰肽相对丰度的%RSD，数据表明，使用PeptideWorks进行样品前处理时，肽的回收率一致，因此定量限也一致。
结论
PeptideWorks胰蛋白酶酶解试剂盒是一套功能全面的试剂盒，适用于QC、生物工艺、分析开发和研究环境中的胰蛋白酶肽图分析样品前处理。 PeptideWorks方案可以手动或自动执行，在2.5小时内生成24个酶解样品。本研究中的NISTmAb样品数据表明，PeptideWorks能够以可重现的方式制备胰蛋白酶肽图分析样品，而不会影响酶解完成度或导致高水平的肽修饰。
参考资料
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720008019ZH，2023年7月
