使用新型信息学工作流程进行mRNA酶解物寡核苷酸图谱分析

LC-MS和信息学技术的前沿进展为科学家设计mRNA关键属性分析的创新策略提供了支持。本应用纪要介绍了mRNA序列图谱分析从使用RNase T2酶进行样品前处理，到使用UPLC™-QTof MS进行数据采集，再到使用新型信息学软件进行数据分析的工作流程。本文详细探讨了结合使用新型RNA酶与自动化软件处理方法，对绿色荧光蛋白(GFP) mRNA进行的酶解后寡核苷酸图谱分析。结果表明，基于寡核苷酸酶解产物的唯一精确质量数，序列覆盖率得以提高。除序列确认外，我们还证明，使用新型RNase T2酶解方法对5'端加帽效率分析也有助益。

优势

• 全新信息学工作流程采用waters_connect™ MAP Sequence应用程序，简化了使用UPLC QTof MS采集数据的mRNA酶解物寡核苷酸图谱分析
• 与传统的RNase T1酶解相比，RNase T2酶（MC1和Cusativin）具有独特的切割特异性，并可生成重叠酶解产物，从而实现更高的序列覆盖率

近期两种针对COVID的mRNA疫苗的研发与获批，将RNA疗法推至生物制药行业的焦点位置^1~3。 由此产生的快速产品开发需求，亟需建立能够精准表征mRNA关键质量属性(CQA)（包括序列完整性与修饰完整性）的分析方法。沃特世此前已开发了两种直接评估mRNA CQA的工作流程：5'端加帽效率测定和Poly(A)尾异质性分析，这两种工作流程均使用waters_connect INTACT Mass应用程序；此外，近期还展示了一种基于MAP Sequence应用程序的新工作流程，用于100 mer单向导RNA的寡核苷酸图谱分析^4,5,6。

传统的寡核苷酸测序技术（如Sanger测序和新一代测序技术(NGS)）因具有成本效益和通量优势已被广泛应用于mRNA的序列分析，但其无法评估mRNA分子在合成与降解过程中产生的多种修饰。相比之下，LC-MS方法因其出色的专属性、灵敏度和定量性能正日益受到关注，能够轻松检测碱基及骨架修饰^7~10。 总体而言，复杂生物制剂的表征需要采用正交技术来全面了解产品质量。

传统的LC-MS RNA酶解物寡核苷酸图谱分析工作流程繁琐耗时，涉及大量人工数据分析与整理工作。在近期发布的一篇应用纪要中，我们介绍了一种UPLC-MS和信息学工作流程，该流程通过使用一系列酶（包括RNase T1、RNase T2（RapiZyme MC1和Cusativin）以及hRNase4）分别酶解sgRNA，进行其序列的自动化图谱分析⁶。 本应用纪要将该工作流程（如图1所示）的应用范围扩展至采用多种RNA酶酶解的更大分子量mRNA，其中包括两种新近推出的RNase T2酶（RapiZyme MC1和RapiZyme Cusativin）。这两种酶具有独特的切割模式，可显著提高序列覆盖率^6,11。 通过快速（<2分钟）自动化分配sgRNA酶解产物，并结合简化的数据处理与审查界面，该流程为sgRNA分析提供了显著优势，同时有望在更复杂的mRNA表征任务中进一步提升效率。此外，与广泛使用的RNase T1酶解方法相比，RapiZyme MC1和RapiZyme Cusativin酶解方法可对mRNA加帽效率的共测量展现出更优的结果。

试剂和样品前处理

二异丙基乙胺（DPA，纯度99%，产品目录号D214752–500ML）和1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP，纯度99%，产品目录号105228-100G）购自Millipore Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。甲醇（LC-MS级，产品目录号34966–1L）购自Honeywell（美国卡罗来纳州夏洛特）。HPLC级I级去离子(DI)水使用Milli-Q系统（Millipore，美国马萨诸塞州贝德福德）净化。流动相每日现配现用。用于mRNA酶解的无核酸酶超纯水（产品目录号J71786.AE）购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。

基于水母绿色荧光蛋白(GFP)序列的mRNA结构由Biosynthesis（美国德克萨斯州路易斯维尔）通过IVT（体外转录）合成方法定制而成。合成的mRNA分子具有Cap1结构（序列为：7MeGpppA(2'-OMe)，元素组成：C32H42N15O26P5），其后含有1019个核苷酸，无Poly(A)尾序列。

经色谱纯化、不含动物源组分的核糖核酸酶T1（产品目录号LS01490，500 kU），从米曲霉中分离获得，购自Worthington Biochemical Corporation（美国新泽西州莱克伍德）。将冻干酶溶于5 mL 100 mM碳酸氢铵（产品目录号5.33005-50G，Millipore Sigma）中，制备100单位/μL的溶液。使用RNase T1酶解mRNA时，将5 μL 5 µM GFP mRNA与25 μL无核酸酶的水和10 μL RNase T1酶（1000单位）混合，在37 ^oC下酶解15分钟。在QuanRecovery™ MaxPeak™ 300 µL样品瓶中制备酶解混合物，随后立即以5 μL进样体积对酶解物进行LC-MS分析。

RapiZyme MC1（P/N：186011190，10000单位/管）和RapiZyme Cusativin（P/N：186011192，10000单位/管）是沃特世公司最近推出的两款新型RNA酶^6,7。 RapiZyme MC1和Cusativin的GFP mRNA酶解方案非常相似。使用RapiZyme MC1时，将GFP mRNA（10 μL，5 µM溶液）置于含有200 mM乙酸铵的缓冲液(pH 8.0)中，在90 ^oC下处理2分钟使其变性。使用RapiZyme Cusativin时，将mRNA（10 μL，5 µM溶液）置于含有200 mM乙酸铵的缓冲液(pH 9.0)中，在90 ^oC下处理2分钟使其变性。两种样品均置于冰上冷却，然后用微量离心机处理以收集样品液滴。加入50单位的酶（RapiZyme MC1或RapiZyme Cusativin各为1 μL）和8 μL无核酸酶的水，使最终体积约20 μL，然后在Eppendorf恒温混合器中在37 ^oC下将mRNA酶解60分钟。将溶液加热至70 ºC并保持15分钟，使酶失活，从而终止酶解。随后立即以5 μL进样体积对酶解物进行LC-MS分析。

所有数据集均使用waters_connect UNIFI™应用程序3.6.0.21版采集，随后使用MAP Sequence应用程序在mRNA Cleaver和Coverage Viewer MicroApps的协助下进行处理。

随着生物治疗机构不断改进产品开发流程，LC-MS方法在RNA序列分析中的应用愈加广泛，这项技术有助于实现更全面的初始表征和持续可靠的序列确认。色谱重现性和分离度的提升、高分辨率MS的易用性增强，以及MS系统灵敏度和准确度的改进，使得序列确认和碱基修饰检测更加可靠。最重要的是，新型寡核苷酸信息学工具使RNA图谱数据分析这一艰巨任务变得更快捷、更简单。

虽然LC-MS用于生物制药蛋白的酶解肽图分析已十分常规，但将类似方法应用于RNA仍更具挑战性。与由20种不同氨基酸组成的蛋白质不同，mRNA仅含有四种构成单元（A、C、G、T），这使得生成具有唯一质量数可对mRNA进行图谱分析的寡核苷酸酶解产物更加困难。高频率切割酶（如具有G-切割特异性的RNase T1）会产生大量同分异构体甚至完全相同的mRNA酶解产物，导致序列分配模糊。而低频率酶切位点的酶能够产生更长的酶解产物，尤其是在生成部分漏切寡核苷酸的情况下。本研究中采用的新型RNase 2型酶（RapiZyme MC1和RapiZyme Cusativin）更有可能产生具有唯一质量数的可分配酶解产物。

本研究设计了一套信息学工作流程（图1），采用waters_connect MAP Sequence应用程序进行数据处理和序列分配，有利于对酶解和UPLC-MS数据采集后采集的LC-MS数据集进行快速、自动化的数据处理⁶。 第一步，使用mRNA Cleaver MicroApp生成指定mRNA分子的预测模拟酶解寡核苷酸产物。第二步，waters_connect MAP Sequence应用程序处理UPLC-MS数据，并将预测的酶解寡核苷酸中性单同位素质量数与实验MS1数据匹配。最后一步，使用Coverage Viewer MicroApp汇总并查看mRNA酶解物的序列覆盖率。

由于该工作流程利用RNA酶解产物的精确质量数测量来进行寡核苷酸图谱分析，因此通过酶解生成明确、独特的产物，以减少对MS2碎片离子数据用户干预的依赖，对解决分配不明确的问题至关重要。RapiZyme MC1和RapiZyme Cusativin酶具有独特的切割特异性，还可以通过调节酶量和酶解时间刻意产生漏切，生成更长的独特酶解产物。本研究使用非数据依赖型MS^E采集确认寡核苷酸酶解产物的分配结果。未来版本的应用程序中将纳入高能量MS^E碎片离子信息，特别用于解决一些残留的模糊分配问题。

mRNA寡核苷酸图谱分析

本研究使用三种不同的核糖核酸酶（RNase T1、RapiZyme MC1和RapiZyme Cusativin）酶解GFP mRNA样品，采集了三个独立的LC-MS^E寡核苷酸图谱数据集。使用MAP Sequence应用程序处理这三个UPLC-MS^E数据集，参数如图2所示，并将结果导出至Coverage Viewer MicroApp以快速查看序列覆盖率。图3A、4A和5A分别展示了RNase T1、RapiZyme MC1和RapiZyme Cusativin的TIC色谱图。据了解，与RNase T1相比，MC1和Cusativin会产生明显更多的漏切，这一酶解特征清楚地反映在图4A和5A所示的复杂色谱图中^6~9。

序列图谱分析结果的比较（图3B、4B和5B）表明，RNase T1的模糊分配酶解产物数量更高，因此其独特覆盖率显著较低（约60%，图3B），而MC1（约97%，图4B）和Cusativin（约85%，图5B）的覆盖率较高。导致这一结果的直接原因是，RNase T1的切割特异性更广（在每个G残基后切割），而MC1和Cusativin的切割特异性依赖于高度特异的二核苷酸基序^6~9。 MC1在尿苷残基的5'端切割，有三个主要酶切位点(A_U / C_U / U_U)和两个次要酶切位点(C_A / C_G)。Cusativin在胞苷残基的3'-端切割，有四个主要酶切位点(C_A / C_G / C_U / U_A)和三个次要酶切位点(A_U / G_U / U_U)。RNase T1会在其所有酶解产物的3'端添加一个线性磷酸基团，而MC1和Cusativin产生的酶解产物主要以3'环状磷酸形式存在。

与RNase T1相比，MC1和Cusativin产生受控漏切的能力也更高，因此在mRNA Cleaver预测工具中，这两种酶允许最多4个漏切，而RNase T1只允许2个漏切。由于漏切数量更多，MC1和Cusativin产生的酶解产物相比RNase T1更长。这些更长的寡核苷酸产物更可能具有唯一质量数，从而降低出现模糊分配的可能性。得益于这些酶解特征，MC1和Cusativin的图谱分析结果表现出更高的覆盖率。

如果序列分配模糊，可以使用waters_connect中的CONFIRM Sequence应用程序进一步研究高能量MS^E数据，将碎片离子分配给可能性最高的寡核苷酸序列¹²。为阐明此方法，我们选择了一对由RNase T1酶解GFP mRNA产生的16 mer酶解产物。这对结构异构体为U251:G266（序列UCC UUC CCC UCA CUC G）和C555:G570 (CCC UCC CCU CUA UCU G)，二者的核苷酸组成相同。如插图（图6顶部）所示，MAP Sequence自动基于多个母离子（电荷态2~9）找到这两个序列，并将它们标记为“替代产物分配”(alternative product assignments)。图6还显示了相应三电荷母离子(m/z=1654.86)的提取质量色谱图，指示存在一个高丰度色谱峰，该峰可能属于一种或两种寡核苷酸产物。使用CONFIRM Sequence自动分配在该寡核苷酸酶解产物的高能量ESI-MS^E谱图中（图7）检测到的碎片离子，可靠地揭示C555:G570序列的匹配，序列覆盖率达到100%。

沃特世之前发布的应用纪要中介绍了几个mRNA加帽分析示例^5,13。mRNA帽状结构位于mRNA的5'端，通常由一个完全成熟的7-甲基鸟苷通过三磷酸酯键以5'-5'连接方式与mRNA结合(m7Gppp)。对于GFP mRNA，我们使用了一种Cap1结构变体，即腺苷残基经2'-O-甲基化修饰后再连接到mRNA上。因此，GFP mRNA的Cap1结构用m7GpppAm表示。

未加帽和加帽的GFP 5' mRNA酶解产物均在MC1 mRNA酶解物中检出，如图8的提取质量色谱图所示。经MC1酶解后，未加帽版本（m/z=1419.5302，-3）在22.0 min处洗脱（上图，图8A），Cap1修饰版本（m/z=1700.8962，-3）在24.7 min处洗脱（下图，图8B）。使用这些三电荷态XIC峰的积分峰面积，计算出加帽效率为79.8%。

根据检测到的最高丰度电荷态([M-3H]3-)的同位素分布（图9），进一步鉴定这些寡核苷酸物质。图8A突出显示了序列为GGA AGA CCC AAG C的游离（未加帽）13 mer MC1酶解寡核苷酸的单同位素峰，下图（图8B）显示了Cap1修饰的13 mer寡核苷酸的单同位素峰。在本例中，MC1和Cusativin在切割GFP mRNA的5'端后产生了相同的酶解产物（序列GGA AGA CCC AAG C），从而能够测量mRNA加帽效率。但在RNase T1酶解案例中，由于5'端的第一个mRNA残基是鸟苷，导致未加帽的酶解产物过短（仅一个核苷酸），在所用的IP-RP条件下无法保留。因此，只能检测到Cap1酶解产物（序列m7GpppAmGp，最高丰度单同位素离子：m/z=602.5482，-2，数据未显示），并且无法测量mRNA加帽效率。因此，对于GFP mRNA，只有MC1和Cusativin可以成功用于计算加帽效率。

这些结果突显了质谱技术目前在大分子mRNA序列确认中的实用性，但工作流程效率和自动化仍有提升空间，且仍是活跃的研究方向。未来需持续开发处理此类复杂数据集的自动化软件，并扩展酶的工具库，以进一步提升这一新兴方法的实用性。

• 本研究展示了一套全新的信息学工作流程，该流程采用沃特世的waters_connect MAP Sequence应用程序，可利用UPLC-MS采集的数据对mRNA酶解物进行MS1寡核苷酸图谱分析。
• 与RNase T1相比，两种新型的RNase T2酶（RapiZyme MC1和RapiZyme Cusativin）具有独特的酶解特异性，能够生成更多的完全酶解寡核苷酸和漏切寡核苷酸，从而实现更高、更可靠的重叠序列覆盖率。
• 使用waters_connect CONFIRM Sequence应用程序将高能量碎片离子与同分异构寡核苷酸序列匹配，从而区分寡核苷酸酶解产物的同分异构体

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