臨床研究のための Xevo™ TQ Absolute 質量分析計を用いたアルドステロンおよび血漿レニン活性の LC-MS/MS の同時分析

レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系（RAAS）は、鉱質コルチコイドステロイドホルモンであるアルドステロンの作用による血液量の増加、またはレニン-アンジオテンシン経路の活性化による血管収縮の増加により、血圧ホメオスタシスを維持する上で非常に重要です。アルドステロンおよび血漿レニン（またはアンジオテンシン I 生成の速度を測定する血漿レニン活性（PRA））の分析は、特に臨床研究における新しい治療法の評価において、RAAS の状態を評価するために使用されます。

歴史的に見て、アルドステロンおよび血漿レニン活性の評価には、免疫測定法を使用する別の分析法が使用されていました。最近では、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS/MS）プラットホームが使用されるようになっています。臨床研究に LC-MS/MS を使用する利点の 1 つは、同じシステムを使用して、さらには同じ分析内で、プロテオームとメタボロームにわたる複数の分析種を測定することができる点にあります。そのため、より短い時間と低いコストで、より多くの情報が得られます。ここでは、臨床研究目的での血漿アルドステロンとレニン活性の組み合わせ測定用の単一の LC-MS/MS 分析法を評価します。 

アプリケーションのメリット

• アルドステロンおよび血漿レニン活性を単一の分析法で測定することで、分析にかかる時間およびコストを削減
• アルドステロンおよび血漿レニン活性を分析するための高感度な分析法
• リキッドハンドリングロボットを使用した自動化に適した抽出メソッド

レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系（RAAS）は、鉱質コルチコイドステロイドホルモンであるアルドステロンの作用による血液量の増加、またはレニン-アンジオテンシン経路の活性化による血管収縮の増加により、血圧ホメオスタシスを維持する上で非常に重要です。アルドステロンおよび血漿レニン（またはアンジオテンシン I 生成の速度を測定する血漿レニン活性）の分析は、特に臨床研究における新しい治療法の評価において、RAAS の状態を評価するために使用されます。

アルドステロンと血漿レニン（または血漿レニン活性）の分析は、従来は別の分析法（通常はリガンド結合法を使用）で行われてきました。最近では LC-MS/MS の人気が高まっています。それは、リガンド結合法で見られた制限を克服できると同時に、同等レベルの分析感度が得られることが確立されたためです。臨床研究に LC-MS/MS を使用する利点の 1 つは、同じシステムを使用して、さらには同じ分析内で、プロテオームとメタボロームにわたる複数の分析種を測定することができる点にあります。そのため、より短い時間と低いコストで、より多くの情報が得られます。ウォーターズでは、Oasis™ MAX 96 ウェル µElution プレートと、Xevo™ TQ Absolute 質量分析計を搭載した ACQUITY UPLC I-Class FL を使用した分析法を開発しました。これにより、ステロイドホルモン、アルドステロン、ペプチド、アンジオテンシン I の抽出および分析ができ、臨床研究での RAAS の状態が評価できます。

キャリブレーション試薬は、2%（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）含有のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で、アルドステロンおよびアンジオテンシン I（血漿レニン活性）についてそれぞれ 28 ～ 6940 pmol/L および 0.23 ～ 58 nmol/L（0.08 ～ 19 nmol/L/時間）の範囲に調製しました。異なる品質管理（QC）セットとして、アルドステロンおよびアンジオテンシン I（血漿レニン活性）には 2%（w/v）BSA 含有 PBS 溶液を使用して、アルドステロンにはプールされたヒト血漿（BioIVT、英国）を使用して、社内で調製しました。血漿レニン活性の精密評価用に、Lyphocheck Hypertension Markers Controls（Bio-Rad、英国ワトフォード）を購入しました。

SI 単位を従来の質量単位に変換するには、アルドステロンの場合は 2.774（pmol/L から pg/mL）、アンジオテンシン I の場合は 0.771（nmol/L から ng/mL）で除算します。

サンプルを迅速に解凍して、血漿プロレニンのレニンへの低温活性化を最小限に抑えました。サンプルは使用前に混合してから、遠心分離機にかけました。
アンジオテンシンの I 世代： 125 µL の血漿を、新しく調製した世代のバッファーで 1：1 に希釈しました。サンプルを密封し、混合して、37 ℃ で 3 時間インキュベーションしました。内部標準試料（SIL）を追加し、続いて 1%（w/v）アンモニア水溶液を追加しました。

アルドステロンおよびアンジオテンシン I の固相抽出：Oasis MAX µElution プレートを、メタノールと 1%（w/v）アンモニア水溶液でそれぞれコンディショニングおよび平衡化しました。上清 650 µL を固相抽出（SPE）プレートにロードしました。サンプルは 1%（w/v）アンモニア含有 20% メタノール水溶液で洗浄しました。1 mL の 96 ウェルコレクションプレートに 30% アセトニトリル水溶液でアルドステロンを溶出させた後、同じプレートに 0.5%（v/v）ギ酸含有 5% アセトニトリル水溶液を用いてアンジオテンシン I を溶出させました。サンプルは、LC-MS/MS システムに注入する前に、密封し、混合して、遠心分離しました。

LC-MS/MS 分析：ACQUITY UPLC I-Class FL システムを使用して、パーシャルループモードで注入が実行されました。XBridge™ Premier Peptide BEH C₁₈ カラム（130Å、2.5 µm、2.1 × 50 mm）と、移動相に 0.2 mM フッ化アンモニウム水溶液およびアセトニトリルを用いて、アルドステロンとアンジオテンシン I が分析時間 3.2 分で分離されました。Xevo TQ Absolute 質量分析計の MRM モードでの極性切り替えを使用して、アルドステロン（ESI-）、アンジオテンシン I（ESI+）、およびそれぞれの内部標準試料を検出しました。

XBridge Premier Peptide BEH C₁₈ カラムを使用して、クロマトグラフィー分離を実施しました。アルドステロンおよびアンジオテンシン I は注入から 2 分以内に溶出しました（図 2）。

高濃度サンプルに続いてブランクを注入した場合に、顕著なシステムキャリーオーバー（最も低いキャリブレーターの 20% 未満）は観察されませんでした。2%（w/v）BSA 含有 PBS を使用した 1：5 希釈では、アルドステロン 25,700 pmol/L と血漿レニン活性 73 nmol/L/時間の高濃度サンプルが正常に分析され、それぞれ 93% および 94% の平均正確度が得られました。

同様の極性を持つ他の構造的に関連性のある化合物およびその他の存在量の多い内因性化合物を個別に検討したところ、アルドステロンおよびアンジオテンシン I の保持時間においては大きな干渉は観察されませんでした（回収率は ±15%バイアス内）。

アルドステロンおよびアンジオテンシン I がスパイクされた 2%（w/v）BSA 含有 PBS 中のサンプルを使用して、キャリブレーション範囲内およびキャリブレーション範囲以下で分析感度の調査を 3 回（各濃度につき n = 30）実施しました。このメソッドでは、アルドステロンでは 28 pmol/L、血漿レニン活性では 0.08 nmol/L/時間で、正確な定量（RSD 20% 未満、S/N（PtP）10：1 未満）が可能になります。

再現性および併行精度は、連続しない 5 回にわたって、1 日あたり 3 濃度の QC 試料を 5 回の繰り返しで抽出および定量することによって測定しました（n = 25）。アルドステロン濃度 83、833、5553 pmol/L と、血漿レニン活性 0.23、2.3、15.4 nmol/L/時間で 2%（w/v）BSA 含有 PBS で調製した QC について、再現性および併行精度は CV 6.8% 以下でした。アルドステロン濃度 133、963、5450 pmol/L で調製したヒト血漿 QC の再現性および併行精度は 5.6% CV 以下でした。血漿レニン活性 2.0、5.7、12.7 nmol/L/時間で調製した Bio-Rad QC の再現性および併行精度は 7.5% CV 以下でした（図 3）。

この分析法は、高濃度と低濃度のプールの分析種を異なる比率で組み合わせて分析したところ、アルドステロン濃度 22 ～ 8328 pmol/L およびアンジオテンシン I 濃度（血漿レニン活性）0.18 ～ 70 nmol/L（0.06 ～ 23 nmol/L/時間）の範囲にわたって直線性があることが分かりました。さらに、2%（w/v）BSA 含有 PBS の検量線は直線であり、すべての分析での決定係数（r²）は 0.995 超でした。

個別のドナーの血漿を用いて、アルドステロンのマトリックス効果について検討を行いました。分析種対内部標準のレスポンス比に基づいて正規化されたマトリックス係数の計算により、イオン化抑制が内部標準により補正されることが示されました。アルドステロンでは 89 ～ 99%、血漿レニン活性では 96 ～ 105% の範囲のマトリックス係数となりました。

スキーム LC-MS 平均への一致を評価するために、英国 NEQAS の 39 のアルドステロン EQA サンプルの分析を実施し、デミング回帰およびブランド-アルトマン分析の両方を使用してデータを評価しました。デミング回帰では y = 0.93x+2.14 の一致が得られ、ブランド-アルトマン分析では平均分析法バイアス -6.1% が得られ、アルドステロンの EQA LC-MS 平均値と良好な一致が見られました（図 4a～b）。 

アルドステロンおよび血漿レニン活性について、2 つの独立した LC-MS/MS 分析法で以前に分析されたサンプルを使用して、分析法の比較を行いました。58 のアルドステロンサンプルの比較では、パッシング-バブロック回帰 y = 0.96x-2.49、ブランド-アルトマン分析で平均分析法バイアス -6.0% が得られました（図 5a–b）。61 の血漿レニン活性サンプルの比較では、パッシング-バブロック回帰 y = 1.27x-0.02、ブランド-アルトマン分析で平均分析法バイアス 21.4% が得られました（図 5c-d）。

Xevo TQ Absolute 質量分析計の新しいメリットとして、アルゴンまたは窒素をコリジョンガスとして使用できることが挙げられます。同レベルの分析感度が得られた場合、異なるガスを使用して、サンプルセット間で直接比較します。さらに、窒素を使用した場合の 28 の血漿サンプルのアルドステロン比較では、デミング回帰 y = 0.90x+7.87、ブランド-アルトマン分析で平均分析法バイアス -8.2% が得られました。窒素を使用した場合の 34 の血漿サンプルの PRA 比較では、デミング回帰 y = 0.94x+0.09、ブランド-アルトマン分析で平均分析法バイアス 1.7% が得られました。

Xevo TQ Absolute 質量分析計を使用して、アルドステロンおよび血漿レニン活性の分析用に、高感度で選択性の高い臨床研究用の分析法が開発されました。

Xevo TQ Absolute 質量分析計では、わずか 125 µL のサンプル容量で、生理的に低レベルのアルドステロンおよび血漿レニン活性（それぞれ 28 pmol/L および 0.8 nmol/L/時間）を同時に分析できます。キャリブレーション範囲全体にわたって優れた精度性能が実証されました。アルドステロン EQA サンプルの評価では、この分析法によりスキーム LC-MS 平均値との良好な一致が示されました。また、アルドステロンおよび血漿レニン活性については、独立した分析法と比較したところ、良好な一致が実証されました。さらに、アルゴンと窒素をコリジョンガスとして使用した場合に、同等の性能が実証されています。これにより、Xevo TQ Absolute 質量分析計の据付時に、アルドステロンおよび血漿レニン活性を分析するための追加のオプションがラボに提供されます。

謝辞

LC-MS/MS 分析法の比較用に匿名化された血漿サンプルを提供していただいた、Manchester University NHS Foundation Trust（英国マンチェスター大学 NHS 基金トラスト）のチームに感謝します。